病毒的鸡胚培养法
病毒的鸡胚培养法接种途径
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
《动物病毒学实验》课件：实验一 病毒在鸡胚中的培养
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚 接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
➢温度：37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 ➢翻卵：从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死 胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1. 绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2. 尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3. 卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4. 羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
6.用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中， 周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用 石蜡密封。
8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
实验八 病毒鸡胚接种与细培养
兽医微生物实验教学课件
（动物医学本科专业）
动物医学系
实验八 病毒鸡胚接种与培养
目的要求：
1、了解不同日龄鸡胚接种的途径和应用。 2、掌握鸡新城疫病毒鸡胚尿囊腔接毒、收毒方法。 3、掌握鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒分离培养
分离培养：动物接种——原动物/实验动物 鸡胚接种——尿囊腔、卵黄囊、尿囊膜、羊膜腔等
细胞培养——原代细胞
二倍体细胞 传代细胞
cpe观察空斑ຫໍສະໝຸດ 基因克隆/扩增组织块培养——肠管、气管环等
鸡 胚 成 纤 维 细 胞 培 养 程 序 ：
在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚 ↓ 除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块 ↓ 用Hanks液等充分冲洗 ↓ 剪将其剪成lmm大小的碎块 ↓ 加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗 ↓ 约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8 ↓ 37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次 ↓ 吸弃上层胰酶溶液 ↓ 用洗液轻洗2次后 ↓ 吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液 ↓ 准备细胞计数 ↓ 单层细胞培养
实验内容：
1、鸡胚的选择和接种途径：鸡胚发育正常时，可见清晰的血管和活 的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。 卵黄囊接种：6-8日龄的鸡胚； 绒毛尿囊腔接种：9-13日龄的鸡胚； 鸡胚血管注射：12-13日龄鸡胚； 羊膜腔和脑内注射：10日龄鸡胚。 2、鸡新城疫病毒接种液或接种病料的处理；照蛋、打孔；接种。接 种后的检查和收毒。 3、鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒的鸡胚培养
实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。
2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。
2。
病毒的培养方法哪几种
病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。
通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。
本文将介绍几种常见的病毒培养方法。
一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。
病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。
这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。
通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。
二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。
在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。
通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。
三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。
科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。
通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。
然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。
四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。
通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。
这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。
然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。
总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。
不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。
鸡胚法病毒分离培养作业指导书
1.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。
2.依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五>3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定4.实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。
在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。
5.标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。
5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。
标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。
标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。
收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。
按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。
咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。
处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种教学目标使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。
材料准备1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。
2.种毒新城疫病毒悬液。
3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。
4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。
方法步骤（一）鸡卵的保存、孵育及检卵1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。
2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。
将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。
3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。
鸡胚的生长情况分为以下几类：（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。
（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。
（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。
（二）各种途径的鸡胚接种方法1.尿囊腔接种（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。
在气室中心或远离胚胎侧气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。
以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。
孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。
实图6-20鸡胚的结构实图6-21尿囊腔接种（2）收获方法收获时间须视病毒的种类而定。
新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。
病毒的鸡胚培养法
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
鸡胚培养法
鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
鸡胚培养——精选推荐
鸡胚培养病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, ⼊孵前0.1%新洁尔灭消毒表⾯. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的⾓度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除⽆精蛋和死胚蛋, 第九⽇起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释⾄效价为1:1280备⽤, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采⽤第9-10⽇龄的鸡胚, 进⾏尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出⽓室和⼤⾎管位置b ⽓室底边胚胎附近⽆⼤⾎管处标记注射位置c ⽓室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和⽓室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹⾓刺⼊3-5mm, 注射病毒液f ⽯蜡封⼝孵育: ⽓室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换⽓, 捡出24⼩时内死亡的鸡胚, 培养48⼩时, 搜集24⼩时以后死亡的鸡胚,收获: 48⼩时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1⼩时,避免收获时流⾎.⽓室端卵壳表⾯消毒, 镊⼦击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒⽑尿囊膜, 吸出尿囊液和⽺⽔, ⽆菌容器4℃保存待⽤. 同时可以取出鸡胚, 观察有⽆出⾎, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离⼼（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离⼼（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。
沉淀物⽤pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并⽤0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的⾎凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备⽤，临⽤前解冻病毒的鉴定:(1)⾎凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照⽣理盐⽔(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25⽣理盐⽔(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得⾎凝滴度.(2)毒⼒测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数⽣长期, 24⼩时前换培养液, 将所得到的病毒液倍⽐稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养⽫,(⼩时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染⼒所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡⾎红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.⽯蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.⽆菌容器12.碘酒, 酒精, 镊⼦, 剪⼑, 洗管, (打孔器)附:1.病毒⾎球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最⾼稀释倍数的病毒液0.25ml称为⼀个病毒⾎球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄⽣某寄主所需最⼩量病毒是0.1ml稀释⾄1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得⾎管⼩团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动⽆精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, ⾎管昏暗, 折断或飘落。
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。
2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。
3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。
接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。
4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。
5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。
同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。
6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。
收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。
7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。
需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。
鸡胚培养方法
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
5. 封孔
• 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
6. 孵育与观察
• 气室朝上于37℃温箱中孵育； • 以后每天检卵1~2次。 • 弃去24h内的死亡鸡胚： – 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖， 尤其是禽类病毒。
② 鸡胚培养的优点： • 来源充足；
• • • • 价格低廉； 操作简单，无需特殊设备； 易感病毒谱较广； 对接种的病毒不产生抗体。
③ 鸡胚培养的缺点： • 非SPF鸡胚，可能含有某些家
禽病毒的母源抗体，甚至还可 能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形 体、鸡白血病等病毒。
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种： • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种： • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种： • 羊膜腔接种 • 静脉接种
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 一般能尿囊液6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
四、实验内容
以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法： 1. 照胚：
食品生物技术《实验三 动物病毒的鸡胚培养》
实验三动物病毒的鸡胚培养一、实验目的掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用三、器材1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。
2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。
四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。
2接种〔1〕绒毛尿囊膜接种℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。
℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。
℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。
病毒的鸡胚培养及效价测定
（3）接种病毒：用18mm针头的1ml注射器吸 取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针， 刺入尿囊腔，注入0.1ml。 （4）用融化的石蜡封闭小孔，39℃孵化器中 孵化72h。
3 收获：
接种后每4小时照蛋一次，弃去24h内死亡胚。
（1）鸡胚放入普通冰箱内冷藏12h，使胎血凝固。
（2）分别用碘酒和酒精消毒卵壳，用灭菌剪刀除 去气室卵壳及壳膜，撕开下面的尿囊膜。 （3）将鸡胚稍倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液 待检。 （4）观察鸡胚的发育及是否有无病变。
22吸吸5050ulul病毒液于第一排第病毒液于第一排第11孔孔混匀后取混匀后取5050ulul至第22孔孔依次稀释至第依次稀释至第1212孔孔弃去弃去5050ulul各各孔经倍比稀释后稀释度依次为孔经倍比稀释后稀释度依次为221122121233第一排第一排111212孔及第二排孔及第二排111212孔各加孔各加11鸡红细胞胞5050ulul微型震荡器震荡微型震荡器震荡22minmin混匀44室温静置室温静置10103030分分观察结果观察结果
பைடு நூலகம்
称为血凝抑制试验。
器材及试剂:
待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；
待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、 加样器等。
实验步骤
（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步
骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12 孔加生理盐水50ul为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul 至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各 孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
实验六 病毒的鸡胚培养及效价测定
目的意义： 了解动物病毒鸡胚培养的意义及用途 掌握病毒鸡胚培养的基本方法 基本原理： 鸡胚培养是培养某些病毒常用方法,此方法可用 于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及 生产疫苗等。病毒接种鸡胚的途径有多种，主要有 卵黄囊接种、绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、
病毒学实验一鸡胚接种培养
实验要求
• 出勤率 • 实验过程中安静、有序、认真、无污染 • 实验报告书写 • 值日生打扫卫生
注意事项
1 最好选用SPF鸡胚。 2 受精卵入孵后要注意翻蛋。 3 检卵时避免照蛋时间过长引起鸡胚温度下
降过大。 4 接种鸡胚时应尽可能避开血管丰富区域。 5 温箱底盘中要加入足够量的蒸馏水以保持
一定的湿度。
思考题
为什么要将接种后孵化24h内死亡的鸡胚剔除？
鸡胚接种
1 选用9～11日龄发育良好的鸡胚。 2 在接种前用检卵器观察并标记出胚胎的气室及胚胎位置，
在气室下边的胚胎附近没有大血管区域标示出尿囊腔接种 部位。 3 把鸡胚气室向上放置于蛋托上，对接种的气室蛋壳表面 用酒精棉和碘酊消毒。 4 将钻孔器在酒精灯火焰下烧灼消毒后，在气室卵壳端打 孔，用1ml注射器吸取接种0.1ml病毒液，从气室下的蛋 壳侧面经气室将针头斜刺入要接种的尿囊腔部位约1.5cm， 注入接种液。 5 用熔化的蜡封闭卵壳上的孔，气室朝上置于温箱内孵育。 6 对已接种的鸡胚每天在检卵灯下检查胚卵，发现鸡胚死亡 立即放入冰箱，将24h内死亡的鸡胚剔除。 7 2～4天后，收获尿囊液。
• 实验原理：尿囊腔接种法广泛应用于病毒 的适应和传代培养，病毒被注射到尿囊腔 后，可在内皮细胞中被复制，复制的病毒 被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含 有大量的病毒。
实验器材
• 鸡胚、孵化设备、检卵器、钻孔器、蛋托、 超净台、冰箱、酒精灯、碘酒、酒精棉球、 注射器、蜡烛
鸡胚繁殖病毒技术
一、鸡胚的选择
• 1、冻干苗应选择受精率比较高的（90%以 上）SPF种鸡蛋，鸡蛋必须新鲜、洁净。原 因是SPF种鸡蛋不携带致病微生物，生产出 来的疫苗更安全。SPF种鸡蛋没有干扰病毒 增殖的母源抗体，与普通种蛋相比能明显 提高病毒含量。 • 2、灭活苗可以选择受精率比较高的（90% 以上）普通低免疫蛋，好处就无菌检验： • 收获的病毒液如果用于冻干苗的生产要逐瓶进行 无菌检验。 • 检验方法：先准备好检验培养基每套2支酪胨琼脂 和2支硫乙醇酸盐，将培养基与收获的病毒液对应 编号，每瓶病毒液用灭菌的注射器抽取2ml左右， 每支加入0.5ml左右，盖好塞后分别放入37℃和 25℃培养箱中培养，5天后观察结果，固体培养 基斜面上有菌生长、液体培养基变浑浊的判为污 染，应弃去不用。
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
1、接种方法：
• 根据不同的病毒（或其他微生物）选择不 同的接种方法。包括尿囊腔接种、绒毛尿 囊膜接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、静 脉接种、脑内接种等。
• 其中最常用的方法是尿囊腔接种，方法是 取9～10日龄鸡胚，画出气室范围，离气室 边缘0.3～0.5mm无大血管处做一个记号， 作为接种孔的位置。先用5%的碘酊消毒， 15分钟后用75%的酒精脱碘，然后用消毒 的锥子在记号处打一个小孔，用1ml注射器 的针头刺入0.5～1cm，注入种毒，用白蜡 封口。接种后继续孵化，一般温度设定为 37℃左右，相对湿度设定为70%～90%， 继续孵化2～7天，不必翻蛋。
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• 鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫 苗接种方法。这种方法就是对孵化后期的 鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些病毒疫 苗不会对孵化率产生不利的影响，通过这 种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保 护力。
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（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
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（五）实验作业
• 1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什 么问题？
• 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应 注意哪些问题？
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封口后放回孵化器中
培养。
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卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
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3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
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4.废料处理
羊膜腔接种
放回孵化器，使蛋直立 1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜4.羊膜
孵化。
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卵黄囊内接种
选择6-8日龄的鸡胚，
照蛋检查，划出气室
和胎位，并以气室向
上竖立在蛋托上，气
室端的蛋壳经消毒后
以打孔器钻一小孔，
将注射针头刺过小孔，
沿着卵的纵轴刺入约
3cm，然后注入
0.2ml的病毒接种液，
用氧化锌胶布及石蜡
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
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羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
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法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
• 出，使用无菌滤器过滤
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2.接种
• 鸡胚接种的方法有几种：
绒毛尿囊腔内接种 ★★ 绒毛尿囊膜接种 羊膜腔接种 卵黄囊内接种
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鸡胚的模式结构 1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔 4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白
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• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
度45-60%的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，孵 蛋第4天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。多采用 9-11日龄的活胚接种。
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（四）实验方法
• 1.接种前的准备：
• a.鸡胚的准备：选择9-11日龄的鸡胚，在照蛋
时以记号笔勾出气室，于气室稍下方胚胎活跃而 血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号， 作为接种部位。用3%碘酊对接种部位进行消毒， 再用75%酒精棉球擦一遍，在接种定位处打孔， 气室向上竖放于蛋托上。
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绒毛尿囊膜接种
• 取10-12日龄的鸡胚，照 蛋选择血管较少的部位做 一记号，用磨蛋器磨一于 纵轴平行的裂痕，小心挑 开蛋壳，将白色的壳膜用 针尖小心挑破，不要伤及 血管丰富而透明的绒毛尿 囊膜，在气室顶端钻一小 孔，用滴管贴近小孔，轻 轻一吸，绒毛尿囊膜便下 陷成一小凹。
绒毛尿囊膜接种
病毒的鸡胚培养
• （一）实验目的 • （二）实验原理 • （三）实验器材 • （四）实验方法 • （五）实验作业
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（一）实验目的
• 1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 • 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的
操作技术。
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（二）实验原理
• 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚培 养两种方法，而鸡胚培养更为常见。一般 而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分离病毒， 其他动物病如犬瘟热也可经鸡胚分离病毒。