实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
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实验三
1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
实验目的
➢掌握质粒提纯的原理和方法; ➢掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学
会运用内切酶.
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
预习：基因克隆示意图
载体DNA ＋
(限制性内切酶切目 开的 ) 基因
＋
宿主细胞
重组体
实验重组质粒DNA1提6 取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质
粒分子的降解作用。（保护作用）Байду номын сангаас③ Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）
实验重组质粒DNA1提9 取及双酶切鉴定
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表 达 实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因克隆操作过程：
分
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体（gene vector）
＊什么是基因载体
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术 ，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具
(4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程
实验重组质粒DNA1提3 取及双酶切鉴定
2 提取质粒DNA的常规方法:
2.1 核酸分离纯化的总原则：
保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、
糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
实验重组质粒DNA提9 取及双酶切鉴定
(2)质粒的三种构型
① 超螺旋DNA(SC DNA)
实验重组质粒DNA1提0 取及双酶切鉴定
② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋 转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
实验重组质粒DNA1提1 取及双酶切鉴定
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
加入200µl溶液II，温和混匀，冰浴3~5min 加入150µl冰溶液III，温和混匀，冰浴3~5min，12000rpm×5min ③
＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体应具备特点
1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因 大量扩增
2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达 能力）
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性
（DNA变性作用）
实验重组质粒DNA2提0 取及双酶切鉴定
溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验重组质粒DNA提6 取及双酶切鉴定
基因载体类型
质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC）
③ 线状DNA(linear DNA,L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
实验重组质粒DNA1提2 取及双酶切鉴定
(3)质粒DNA的一般特性：
①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
实验重组质粒DNA1提7 取及双酶切鉴定
④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶 消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的 蛋白质。
实验重组质粒DNA1提8 取及双酶切鉴定
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成.
① 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
加1.4ml培养物于EP管，12000rpm×30S ①除去上清，再取1.4ml离心30s ②
除去上清，加入冰的100 µl溶液I，颠倒EP管，混匀
实 验步 骤及 注意 事项
1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
实验目的
➢掌握质粒提纯的原理和方法; ➢掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学
会运用内切酶.
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
预习：基因克隆示意图
载体DNA ＋
(限制性内切酶切目 开的 ) 基因
＋
宿主细胞
重组体
实验重组质粒DNA1提6 取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质
粒分子的降解作用。（保护作用）Байду номын сангаас③ Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）
实验重组质粒DNA1提9 取及双酶切鉴定
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表 达 实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因克隆操作过程：
分
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体（gene vector）
＊什么是基因载体
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术 ，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具
(4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程
实验重组质粒DNA1提3 取及双酶切鉴定
2 提取质粒DNA的常规方法:
2.1 核酸分离纯化的总原则：
保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、
糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
实验重组质粒DNA提9 取及双酶切鉴定
(2)质粒的三种构型
① 超螺旋DNA(SC DNA)
实验重组质粒DNA1提0 取及双酶切鉴定
② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋 转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
实验重组质粒DNA1提1 取及双酶切鉴定
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
加入200µl溶液II，温和混匀，冰浴3~5min 加入150µl冰溶液III，温和混匀，冰浴3~5min，12000rpm×5min ③
＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体应具备特点
1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因 大量扩增
2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达 能力）
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性
（DNA变性作用）
实验重组质粒DNA2提0 取及双酶切鉴定
溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验重组质粒DNA提6 取及双酶切鉴定
基因载体类型
质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC）
③ 线状DNA(linear DNA,L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
实验重组质粒DNA1提2 取及双酶切鉴定
(3)质粒DNA的一般特性：
①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
实验重组质粒DNA1提7 取及双酶切鉴定
④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶 消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的 蛋白质。
实验重组质粒DNA1提8 取及双酶切鉴定
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成.
① 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
加1.4ml培养物于EP管，12000rpm×30S ①除去上清，再取1.4ml离心30s ②
除去上清，加入冰的100 µl溶液I，颠倒EP管，混匀
实 验步 骤及 注意 事项