实验2 细菌的染色和形态观察

微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
使细菌蛋白凝固后保持其固有的外形；改变对染料的通透性。
4 染色： 滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰液1～2滴，使染 液盖满菌膜, 1～2分钟后，用细小流水洗去多余的 染液，在空气中自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。 （切忌拖、拉）
5 镜检观察结果： 用结晶紫染色的葡萄球菌、大肠杆菌或变形杆菌成紫色； 复红染色者均为红色；碱性美兰染色者均为蓝色。
通透性学说：
脱色剂较易通过G-菌的细胞壁，将染料和碘 的复合物溶解洗出，故易脱色。G+菌的细胞壁通 透性低，酒精不易通过，故不易脱色。
近年来认为，95%酒精可使G+菌的细胞壁脱 水形成屏障，染料和碘的复合物不能透出；而G菌不仅无此屏障，且其细胞壁的脂类含量较G+菌 多，酒精对其表面脂类的溶解也可能是G-菌容易 脱色的一个因素。
以辅助鉴别细菌。
细菌染色多采用碱性染料如美蓝、碱性复红、 结晶紫等，原因在于：
1、细菌蛋白质是两性电解质，等电点较低， 在pI2-5之间。故在近于中性的环境中，细菌多带
负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合。
2、细菌胞质中含有大量呈酸性的RNA，也与碱
性染料有亲和性。
细菌的染色方法 单染和复染
单染：用一种染料进行染色
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
2. 低倍镜查找标本视野，加香柏油一滴于标本的待检部位， 换用油镜观察。 3. 从侧面注视油镜头，小心将镜头浸入镜油中，轻柔调节细 调节器进行观察。 4. 观察标本时，双眼同时睁开。 5. 油镜用毕，转动粗调将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸沾 少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。
示教：细菌的基本形态与特殊结构观察
α -溶血
β -溶血
γ -溶血
2）半固体琼脂培养基上细菌生长状态的观察：
清晰（无动力） 注意在穿刺线上细菌生长的状态 向四周扩散（有动力）
3）观察细菌在肉汤培养基上的生长状态： 有无菌膜、菌膜厚度，混浊度， 有无沉淀、沉淀的性质是絮状、粘液状或颗粒状。
空气中细菌的检查——菌落计数的方法
每100cm² 培养基在空气中暴露5分钟，其表面接受自然 沉降的细菌数约相当于10升空气中所含的细菌量。 每块平板的菌落数=4块平板的菌落总数/4 100cm² 面积培养基上的菌落数=（每块平板的菌落数 /πr² ）x100 每 m³ 空气中活菌数=（100cm² 培养基上菌落平均数/30） x1000
复染：两种或两种以上染料进行染色。 革兰染色、抗酸染色、荚膜染色等
（一）简单染色
单染染色步骤
1 涂片：
在玻片上滴一滴生理盐水，然后刮取少许菌苔在盐水中乳磨 使之乳化，涂成直径约为0.5cm - 1cm的菌膜。
2 干燥：
最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干。但 切勿靠火焰以免烤焦标本。
3 固定：火焰固定。 固定的作用：杀死细菌；使细菌与玻片粘附牢固；
2.细菌的基本形态与特殊结构的观察
3.常用的细菌染色方法
掌握：
1. 细菌单染色和革兰染色的方法和意义
2. 细菌染色标本的制备技术
上次结果观察
细菌的分离接种
1）固体琼脂平板培养基上细菌生长状态的观察：
观察平板上可有不同的菌落长出。
菌落大小； 形状（圆形或不规则）； 硬度（粘稠或易碎）； 透明度（半透明、不透明或透明）； 边缘（整齐、不整齐）； 颜色（色素）； 表面（光泽、粗糙、平滑、凸起、凹下、干燥、湿润等）； 菌落与培养基的关系（粘连、溶血与否）。
1、细菌基本形态的观察
2、细菌特殊结构的观察
芽胞、荚膜、鞭毛、菌毛
3、特殊染色结果观察
抗酸染色
细菌的染色
细菌是无色半透明的微小生物，肉眼看不到， 必须借助于显微镜才能够观察。然而，未经染色的
细菌标本，在普通光学显微镜下只能粗略地看见其
形态和大小，只有经过染色后才能观察清楚。染色
后镜检，不但wenku.baidu.com以识别细菌的各种不同结构，还可
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴
半
红
脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：


将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
正常人体皮肤及随身物品的细菌检查
结果：通常除用碘液消毒的手指外，其余手指或
杂物接触的培养基表面都有数量不等的菌落长出。
观察菌落直径大小，形状，透明度，硬度，表面， 边缘，颜色，菌落与培养基关系等。
呼吸道细菌的检查 — 咳碟试验
观察培养基上的菌落形态并进行计数分析。
显微镜油镜的使用与保护
1. 显微镜直立放稳，打开显微镜光源
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
单染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后 刮取菌苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm的 膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、染色：滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰 液染色1～2分钟后，用细小流水洗去多余的染液。 5、镜检
（二）复染
革兰染色法
丹麦的细菌学家C.Gram 1884年发明革兰染色法
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革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴