原位杂交
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此技术最先由Gall和Pardue于1969年 此技术最先由Gall和Pardue于1969年 建立,以后广泛应用于组织学、病理学、 建立,以后广泛应用于组织学、病理学、 遗传学、微生物学等多种生命学科。 遗传学、微生物学等多种生命学科。它可 以检测组织细胞本身的或外源的DNA或 以检测组织细胞本身的或外源的DNA或 RNA序列 这一技术在病理学上, RNA序列。这一技术在病理学上,可使人 序列。 们从基因水平认识疾病的本质, 们从基因水平认识疾病的本质,且在组织 细胞原位显示,有助于诊断或研究信息。 细胞原位显示,有助于诊断或研究信息。 原位杂交技术经过30余年的发展完善 余年的发展完善, 原位杂交技术经过30余年的发展完善,目 前已开始从实验室走向临床, 前已开始从实验室走向临床,例如某些病 毒性疾病、遗传性疾病等。在某些医院, 毒性疾病、遗传性疾病等。在某些医院, ISH已作为一项常规技术得到应用 ISH已作为一项常规技术得到应用。 已作为一项常规技术得到应用。
应用
广泛 Northern Blot Southern Blot DNA—DNA原位杂交 DNA—DNA原位杂交
2 单链cDNA 探针 单链cDNA 来源: M13衍生载 来源:(1)cDNA 导入 M13衍生载 体中,则可产生大量的sscDNA 体中,则可产生大量的sscDNA (2) PCR M13衍生载体构建困难 M13衍生载体构建困难, 加之可 衍生载体构建困难, 供插入M13 有限, 供插入M13 cDNA 有限,此sscDNA 应用不广泛。 应用不广泛。
原位杂交
一、概述 二、基本原理 三、探针 (一)探针种类来源和应用 (二)探针标记的种类 (三)探针标记方法 (四) 标记探针的纯化 四、分类 五、基本步骤 六、注意事项 七、应用
一、概述
原位杂交( ISH) 原位杂交(in situ hybridization ISH)是 应用生物化学的核酸杂交的原理,在组织切片、 应用生物化学的核酸杂交的原理,在组织切片、 细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或 细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA 序列的一项技术。 序列的一项技术。是将分子杂交与组织学相结 合的一项技术, 合的一项技术,也称之为杂交组织化学 (hybridization histochemistry)、细胞杂交 histochemistry)、 (cytological hybridization)或原位杂交组织化 hybridization)或原位杂交组织化 histochemistry)。 学(in situ hybridization histochemistry)。
4 体外转录法:制备RNA探针 体外转录法:制备RNA探针
表1 探针种类及常用探针标记方法 探针类型 双链cDNA 双链cDNA 单链cDNA 单链cDNA 寡核苷酸 单链cRNA 单链cRNA 标记方法 切口移位, 切口移位,引物延伸 引物延伸 末端标记, 末端标记,引物延伸 体外转录
(四) 标记探针的纯化 纯化:将标记反应未被化合的, 纯化:将标记反应未被化合的,即 游离的标记核苷酸与掺入cDNA 游离的标记核苷酸与掺入cDNA or cRNA的标记核苷酸分开 cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的 的标记核苷酸分开, 部分去除。 部分去除。
五、原位杂交的基本步骤 杂交前处理—杂交反应— 杂交前处理—杂交反应—杂交后 处理— 处理—杂交体检测 检测DNA RNA,在取材, 检测DNA or RNA,在取材,固 定及标本制备方面有一些特殊要求。 定及标本制备方面有一些特殊要求。
1 取材:新鲜,尤其是RNA降解快, 取材:新鲜,尤其是RNA降解快 降解快, 要求30min内固定 内固定。 要求30min内固定。 2 固定:固定剂二大类: 固定:固定剂二大类: 交联固定剂:甲醛,戊二醛。 (1)交联固定剂:甲醛,戊二醛。保持 形态好,渗透慢。 形态好,渗透慢。 沉淀固定剂:甲醇,乙醇, (2)沉淀固定剂:甲醇,乙醇,丙 形态差,影响部分双链核酸。 酮。形态差,影响部分双链核酸。 首选4%多聚甲醛 亦可用10%缓冲 多聚甲醛, 首选4%多聚甲醛,亦可用10%缓冲 辐尔马林
3 寡核苷酸探针:PCR技术 寡核苷酸探针:PCR技术 10-50核苷酸 10-50核苷酸 其序列特异结合(靶基因序列), 其序列特异结合(靶基因序列), 且与无关序列不产生杂交反应。 且与无关序列不产生杂交反应。 优点:组织穿透性好,特异性强, 优点:组织穿透性好,特异性强, 稳定性好。 稳定性好。 缺点:灵敏性低( 缺点:灵敏性低(短)
四、原位杂交的分类 1 核酸杂交的类型 液相杂交: 液相杂交:溶液中进行 固相杂交: 固相杂交:纤维素膜支持物上 斑点杂交 Southern Blot Northern Blot
2 根据所用探针和靶核酸的不同 DNA— DNA—DNA DNA— DNA—RNA RNA— RNA—RNA
3 根据探针标记物是否能直接被检测到 ISH可分为 ISH可分为: 可分为: 直接法:放射性, 酶, 荧光 直接法:放射性, 间接法:半抗原。 DIG, 间接法:半抗原。如DIG, Biotin
(三) 探针标记方法 1 切口移位:缺口平移法, 切口移位:缺口平移法, 常用标记DNA方法 常用标记DNA方法 生化、生物物理名词。 生化、生物物理名词。 1990年命名为切口移位。 1990年命名为切口移位。 年命名为切口移位 最常用的标记物为32P 也可用地高辛和生物素标记(Bio— 也可用地高辛和生物素标记(Bio— dUTP or dATP) dATP)
原位杂交是不经核酸提取的步骤, 原位杂交是不经核酸提取的步骤, 在组织细胞原ຫໍສະໝຸດ Baidu进行核酸杂交;再在 在组织细胞原位进行核酸杂交; 显微镜或电子显微镜下观察杂交信号。 显微镜或电子显微镜下观察杂交信号。
三、探针 (一)探针种类、来源和应用 探针种类、
1 双链cDNA探针:从cDNA文库中获得 双链cDNA探针: cDNA文库中获得 cDNA探针 反转录 聚合酶 分离mRNA 分离mRNA cDNA dscDNA 核酸杂交、 核酸杂交、结构分析 筛选目的基因( 筛选目的基因(选出 含目的基因重组体克隆) 含目的基因重组体克隆) 扩增 提取质粒 纯化 酶切 纯化 标记
方法: 方法:层析法或沉淀法 1 层析法 小分子路途长, 小分子路途长,大分子物质先出 2 沉淀法 乙醇沉淀DNA RNA来纯化标记探针, 乙醇沉淀DNA和RNA来纯化标记探针, DNA和 来纯化标记探针 既方便,效果又好,比较常用。 既方便,效果又好,比较常用。 酚、氯仿抽提 乙醇沉淀 干燥 溶解分装冻存备用
(2) 3’末端标记 3’末端标记 5’—3’多聚酶 5’—3’多聚酶 3’—5’外切核酸酶 3’—5’外切核酸酶(dNTPs时,受抑制) 外切核酸酶(dNTPs时 受抑制) 适用于合成的寡核苷酸探针
3’末端标记效率高 3’末端标记效率高,杂交敏感性低 末端标记效率高, 5’末端标记效率低 5’末端标记效率低,杂交敏感性高 末端标记效率低,
二、原位杂交的基本原理
螺旋双链的DNA分子在碱性条件下加 螺旋双链的DNA分子在碱性条件下加 热至100℃(95℃ 98℃ 或加变性剂时, 热至100℃(95℃-98℃)或加变性剂时,其双 链间互补碱基的氢链解开而成为单链, 链间互补碱基的氢链解开而成为单链,此 过程称为变性 过程称为变性。 变性。
2 引物延伸法(Primer extension) 引物延伸法( extension) 3’-OH末端 3’-OH末端, 产量低 末端, 可标记纯度不太高的DNA 可标记纯度不太高的DNA
3 末端标记法(End-labeling) 末端标记法(End(1) 5’端标记 5’端标记 T4多聚核苷酸激酶 T4多聚核苷酸激酶
4 杂交前处理: 杂交前处理: 目的—提高组织通透性, 目的—提高组织通透性,防止非特异 脱蜡(充分) (1) 脱蜡(充分) 去污处理(Tritox—100) (2) 去污处理(Tritox—100)过度会引 起靶核酸的丢失, 起靶核酸的丢失,形态结构破坏 (3) Proteinase K 酸酐和酸处理(碱性蛋白变性, (4) 酸酐和酸处理(碱性蛋白变性,酶去 除降低背景) 除降低背景) 内源性酶,生物素去除: (5)内源性酶,生物素去除:减少非特 异性反应。 异性反应。
这两条互补的核酸单链在一定离子浓度和逐 渐降温时, 渐降温时,其互补碱基间的氢链又可再连接而成 双链核酸分子,此过程称为退火或复性 退火或复性。 双链核酸分子,此过程称为退火或复性。 在退火或复性过程中, 在退火或复性过程中,如果加入外源且序列 互补的单链DNA或RNA片段 片段, 互补的单链DNA或RNA片段,则也可与原来解 开的一条单链互补连接而成异质双链核酸分子。 开的一条单链互补连接而成异质双链核酸分子。 这一合成异质双链核酸分子的过程称为核酸杂交 这一合成异质双链核酸分子的过程称为核酸杂交 或核酸分子杂交。 或核酸分子杂交。 如在加入的单链DNA或RNA片段上加以标 如在加入的单链DNA或RNA片段上加以标 记做为探针 探针(probe), 记做为探针(probe),则可显示出核酸杂交所形成 的杂交子而检出与探针互补的核酸。 的杂交子而检出与探针互补的核酸。
3 标本制备: 标本制备:
石蜡切片:保存形态结构好,敏感性低 石蜡切片:保存形态结构好, 冰冻切片: 形态结构较差, 冰冻切片:厚,形态结构较差,敏感性高 细胞涂片,贴片,爬片(细胞培养时): 细胞涂片,贴片,爬片(细胞培养时): 及时固定,容易有阳性结果, 及时固定,容易有阳性结果,同冰冻切片
防脱片:(石蜡切片) 防脱片:(石蜡切片) :(石蜡切片 PLL (Poly-L-Lysine,多聚赖氨酸) > Poly- Lysine,多聚赖氨酸) APES (3’氨丙基三乙氧硅烷) > 明胶 3’氨丙基三乙氧硅烷 氨丙基三乙氧硅烷) 切片厚度: 切片厚度: 厚, 杂交位号多 5µm(石蜡) 5µm(石蜡) 10µm(冰冻) 10µm(冰冻)
(二)探针标记的种类 1 放射性标记:同位素。 放射性标记:同位素。 最初建立(1969) 最初建立(1969)3H标记 优点: 优点:敏感性最高 缺点:( :(1 缺点:(1)对人体有伤害 (2)半衰期问题
2 非放射性标记 最常用的为生物素(生物素, 最常用的为生物素(生物素,光 敏生物素)和地高辛, 敏生物素)和地高辛,此外还有荧光 和酶类(HRP,AP) 和酶类(HRP,AP) 敏感性:地高辛>生物素, 敏感性:地高辛>生物素, 但价格和操 作流程生物素优于地高辛。 作流程生物素优于地高辛。 荧光标记: 荧光标记:不稳定
4 cRNA 探针 目的基因cDNA片段插入含有特 目的基因cDNA片段插入含有特 异的RNA聚合酶启动子序列 聚合酶启动子序列( 异的RNA聚合酶启动子序列(噬菌体 T7 or SP6)质粒中—扩增,纯化,酶 SP6)质粒中—扩增,纯化, 线形化— RNA聚合酶 聚合酶) 切—线形化— (RNA聚合酶) 体外 转录cRNA( Probe) 转录cRNA(含标记物的 cRNA Probe) 应用: 应用:广泛 单链,无变性问题。 单链,无变性问题。 cRNA—mRNA杂交稳定 cRNA—mRNA杂交稳定 cDNA—mRNA) (较cDNA—mRNA)
5 杂交反应
(1)dsDNA 和靶DNA变性, 加热95℃ 5-15min 和靶DNA变性 加热95℃ 变性, (2) 探针浓度: 0.5µg/ml (同位素) 探针浓度: (同位素 同位素) 2µg/ml (非同位素) (非同位素 非同位素) (3) 杂交液: 杂交液: 5×Denhart’s 液 2% SDS 50% 去离子甲酰胺 5×SSC 100µg/ml 鲑精DNA 鲑精DNA 10% 硫酸葡聚糖