原位杂交
原位杂交和免疫荧光
原位杂交和免疫荧光
原位杂交和免疫荧光是两种常见的分子生物学实验方法。
这两种
方法都可以用于研究生物分子的定位和分布情况，进而揭示生物学过
程和功能。
下面我们分别来介绍一下这两种方法。
原位杂交是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和定位细
胞或组织中特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的基本步骤包括：制备
探针，标记探针，处理样品，杂交和探针探测。
通常情况下，原位杂
交用于检测单个基因或特定基因家族的成员，可用于研究基因组结构、基因表达和基因型等方面。
该技术在医学诊断和药物开发方面也有广
泛应用。
免疫荧光是一种检测生物分子定位和分布情况的常用方法。
它利
用抗体与标记化学物质（如荧光素）相结合，通过荧光显微镜观察生
物分子的定位和分布情况。
免疫荧光主要应用于研究细胞内的蛋白质
定位和分布，也可用于研究病毒感染等方面。
该技术不仅能够静态观
察生物分子的分布情况，还可以通过时间分辨光学显微镜观察生物分
子的动态行为。
虽然原位杂交和免疫荧光技术各自有其独特的应用范围和特点，
但它们有一个共同的优点，即能够在不破坏组织结构的情况下观察分
子分布及定位情况。
这种特性使得这两种技术成为研究生物分子功能
和生物学过程的重要工具。
总之，原位杂交和免疫荧光技术是分子生物学领域内的两个重要
实验方法。
它们都能够在细胞或组织中观察特定生物分子的定位和分
布情况，为揭示生物学过程和功能提供帮助。
原位杂交名词解释
原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。
原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。
2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。
3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。
标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。
4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。
5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。
6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。
原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。
它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。
此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。
总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。
原位杂交
原位分子杂交原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。
它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。
分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization斑点杂交Dot blotSouthern 印迹杂交Northern 印迹杂交原位杂交又称原位杂交组织化学依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子原位杂交原理变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构退火◆杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段◆靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA原位杂交基本原理利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分【原位杂交优点】☞既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性☞既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究☞所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本☞应用范围广探针及其制备探针的长度：以选择50～300bp最为适宜（一）探针的种类与制备根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针cDNA探针（complementary DNA）双链cDNA探针是最常用的核酸探针通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子【制备方法】用生物工程技术获取特异的cDNA片段从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA 文库→筛选和克隆特异cDNA 分子特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组•质粒转化•质粒扩增•质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针【优点】1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究2. DNA探针一般较RNA探针敏感3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆4. 多种标记方法, 可靠易行5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解【缺点】1. 要用凝胶电泳移除载体序列2. 探针需变性3. 杂交反应中可能存在自身复性RNA探针---体外转录技术制得◆一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录◆将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处→DNA重组体→转化细菌→质粒扩增→质粒抽提→体外转录合成RNA探针【优点】☞单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高☞RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定☞通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链反义RNA链---又称cRNA链, 用作杂交的探针正义RNA链---用于杂交的阴性对照☞杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤【缺点】1. 容易受RNA酶污染2. 制备过程复杂3. 杂交适宜的温度范围较宽寡核苷酸探针根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针【优点】1.10~50bp, 在组织内通透性好2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作【缺点】1.与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低3.标记方法受限制, 只能采用末端标记法探针的标记1. 标记物理想的标记物应具备的条件:☞标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同☞标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好☞安全无害目前常用标记物有同位素和非同位素二大类⏹同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和3H◆非同位素标记探针⏹生物素:生物素广泛的存在于动物体内内源性生物素对杂交信号的干扰地高辛:半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取杂交信/噪比高, 敏感性高非同位素标记物中的最佳选择2.标记方法⏹(1) 双链cDNA探针的标记随机引物法(random primed DNA labelling)⏹(2) RNA探针标记---在体外转录技术中与探针制备同时完成(3) 寡核苷酸探针标记---主要是末端标记法(end-labelling )标记探针的纯化与检验纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除纯化的方法:普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法检验:斑点印迹法，液闪法原位杂交方法(一) 探针及其标记(二) 组织样品制备1. 去除或抑制RNA酶物理方法: 1. 对耐高温的实验器具高温烘烤180℃3小时以上2. 实验用试剂, 耐热塑料器具120℃30min化学方法: 杂交用试剂均应用DEPC水配制对不耐热的器具可浸于DEPC水中, 室温处理2~3h实验中注意戴口罩和手套操作DEPC---焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)通过与组氨酸结合而使蛋白质变性配制: 0.1%DEPC水37℃水浴恒温振荡过夜2.取材及固定◆取材：组织要求新鲜如有可能尽量使用灌流固定手术材料最好在组织离体后30min内取材并立即进行固定取材过程中防止RNA酶的污染固定1. 目的：避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整2. 固定方法: 灌流法, 浸泡法浸泡法: 一般将组织块切成0.5~1.0cm3大小, 浸泡于15倍左右体积的固定液中, 固定24hr冰冻切片或细胞培养标本, 固定20~30min3.固定时间4.常用固定剂: 4%多聚甲醛, 10%甲醛包埋和切片石蜡包埋和切片方法同常规操作过程中防止RNA酶污染戴手套操作切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用切片时，用0.1%DEPC水展片新鲜切片60℃烘烤16~24hr玻片的处理❑玻片上涂上粘附剂❑常用粘附剂: APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)多聚赖氨酸明胶❑防脱处理后高温消毒原位杂交实验1.杂交前处理目的:提高组织的通透性，增加靶核酸分子的可及性常用方法:脱蜡，去污剂，表面活性剂：Triton X-100，SDS，Tween蛋白酶：蛋白酶K，胃蛋白酶2.预杂交: 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育3. 探针和靶核酸的变性杂交滴加含有探针的杂交液(20μl/片), 盖上盖玻片或无菌的石蜡膜, 置于湿盒内, 在合适温度的烘箱内杂交❑杂交液钠盐: 5 X SSC (标准柠檬酸钠-氯化钠溶液)50%去离子甲酰胺硫酸葡聚糖牛血清白蛋白, 鲑鱼精DNA等❑探针浓度放射性标记探针---0.5ng/μl非放射性标记探针---2ng/μl⏹PH值: 通常使用缓冲液PH7.2~7.4❑杂交温度: 一般低于相应杂交体的Tm值25℃❑杂交时间❑杂交环境: 湿盒内加少量与杂交液相同渗透压的SSC (5X SSC)杂交后漂洗在高严格度条件下，漂洗除去未参与杂交体形成的过剩探针，消除探针与组织细胞的非特异结合高严格度条件：指高的温度，低的钠离子浓度一般用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→0.5X SSC杂交后信号检测❑同位素标记探针: 放射自显影❑DIG标记探针:AKP或HRP标记的抗DIG抗体显示系统DIG-AKP检测系统: 以NBT/BCIP为底物显色, 结果为紫蓝色沉淀DIG-HRP检测系统: 以DAB/H2O2为底物, 结果为棕阴性对照试验方法作用●杂交前用核酸酶处理如果杂交信号明显降低或消失, 说明探针是与组织细胞中●的核酸杂交●杂交液中省去探针如果出现阳性反应, 说明这些信号是与杂交反应无关的●用正义核酸探针如果无杂交信号, 表明探针的特异性●加过量未标记探针杂交后阻断标记探针与待测核酸的结合, 如杂交再加标记探针杂交信号消失或下降, 表明探针杂交的特异性5. Northern或Southern分析如果在待测核酸的分子量大小处显示一条杂交信号带, 表明探针的特异性6. 将标记探针与未标记探针按如果杂交信号随标记探针量的增加而增一定比例混合, 然后杂交加, 说明探针是特异的实验中可能出现的问题原位杂交实验失败1. 探针探针的敏感性;保存的好坏, 保存时间探针浓度; 探针长度2.组织材料的保存3. 实验过程中防止RNase污染, 做到严格的无RNase操4. 杂交前处理:蛋白酶消化的浓度, 时间PK在冰冻切片浓度为0.5~2μg/ml石蜡切片浓度10~20μg/ml5. 杂交条件: 温度时间6. 杂交体检测脱片☞玻片的防脱处理☞杂交前预处理时蛋白酶的浓度，消化时间☞杂交后漂洗过度非特异性染色☞探针特异性不高☞组织细胞内内源性酶染色内源性过氧化物酶0.5%~5%H2O2内源性碱性磷酸酶1mmol/L左旋咪唑内源性生物素☞杂交后的漂洗2X SSC→1X SSC→0.5X SSC37℃振荡漂洗⏹ 概念：⏹ 原位杂交 ，变性，复性（退火），探针，靶核酸分子 ⏹ 原位杂交基本原理，优点⏹ 探针的种类及优缺点⏹ 探针的标记方法及原理⏹ 组织样品制备时的注意事项⏹原位杂交中可能会出现哪些问题，应怎样避免这些问题⏹原位杂交特性以及与免疫组化比较⏹。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交实验目的
原位杂交实验目的
原位杂交实验的目的是学会原位杂交的使用方法，并了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
通过标记的探针和靶基因反应的专一性（核酸杂交配对），原位杂交技术能够揭示组织内目标核酸的精确定位，展现出在细胞水平甚至亚细胞水平下基因的时空表达情况。
原位杂交技术被广泛应用于各个物种的基因表达检测，包括细胞特异性mRNA转录的定位、感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位、癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测等。
此外，它还被用于基因在染色体上的定位、检测染色体的变化，如染色体数量异常和染易位等，以及分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
以上信息仅供参考，如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询相关学者。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交的原理
原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。
DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。
探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。
在原位杂交实验中，首先需要制备探针。
探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。
荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。
探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。
为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。
此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。
通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。
常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。
总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交技术
原位杂交技术原位杂交技术是一种基因分析技术，可以用来研究细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
本文将介绍原位杂交技术的基本原理、应用领域以及未来发展方向。
原位杂交技术最早是在20世纪70年代发展起来的，主要用于研究DNA在细胞中的位置和分布情况。
其基本原理是利用亲和性标记的探针与目标DNA序列特异性结合，通过显色或荧光等方法来检测标记物的位置。
原位杂交技术的具体步骤包括控制组织或细胞的形态、固定样本、渗透处理、杂交、洗脱、显色和观察等。
其中最关键的步骤是杂交反应，需要合理设计探针的序列和标记方法，并进行适当的条件优化。
原位杂交技术广泛应用于生物医学领域，可以用于寻找新的基因、研究基因的表达调控机制、探索基因组的结构与功能等。
例如，科学家可以用这种技术来研究染色体异常、肿瘤基因的异常表达、发育过程中的基因调控等。
此外，原位杂交技术在遗传学、生物学、植物学、动物学和微生物学等领域也有广泛的应用。
在遗传学中，可以用原位杂交技术检测并分离具有特定基因型的个体；在植物学中，可以研究植物的组织分化和发育过程；在动物学中，可以研究胚胎发育和器官再生等。
虽然原位杂交技术在基因研究中起到了重要作用，但仍存在一些局限性和挑战。
首先，该技术的灵敏度和特异性受到探针选择、探针标记和杂交条件等多个因素的影响。
其次，原位杂交技术在细胞外不易实施，因为固定和渗透处理可能会对细胞和组织结构产生破坏。
未来，随着生物技术的不断发展，原位杂交技术也将得到进一步改进和完善。
例如，可以利用新型的标记物和探针来提高技术的敏感度和特异性，同时也可以开发新的杂交方法来降低对样本的破坏。
此外，结合其他高通量分析技术，如转录组学和蛋白质组学，可以更全面地揭示基因表达和调控的网络。
总之，原位杂交技术是一种重要的基因分析技术，可以揭示细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
在今后的研究中，我们有理由相信原位杂交技术将发挥更大的作用，并帮助科学家们更好地理解生命的奥秘。
基因组原位杂交名词解释_解释说明以及概述
基因组原位杂交名词解释解释说明以及概述1. 引言1.1 概述在遗传学和分子生物学领域，基因组原位杂交是一种常用的实验技术。
通过此技术，我们可以将标记有荧光物质或其他探针的DNA序列与目标细胞或组织中的特定基因进行配对，从而确定该基因在细胞核中的位置和数量。
基因组原位杂交广泛应用于细胞遗传学、肿瘤研究、发育生物学和进化研究等领域。
1.2 文章结构本文将首先解释并概述基因组原位杂交的定义以及其应用场景。
然后详细说明基因组原位杂交的原理和步骤，包括过程概述、探针设计与合成以及样本处理与标记。
接下来，将介绍一些典型的应用案例，并总结当前的研究进展。
最后，文章将给出一个结论部分，总结文章要点，并提出未来发展方向或建议。
1.3 目的本文旨在向读者提供关于基因组原位杂交的名词解释和解释说明。
通过阅读本文，读者将了解到基因组原位杂交在遗传学和分子生物学领域的重要性和应用场景。
同时，读者将深入了解基因组原位杂交的原理、步骤以及样本处理技术。
通过学习应用案例和研究进展，读者可以了解到该技术在不同领域的应用前景，并为未来的研究和发展提供建议。
2. 基因组原位杂交名词解释2.1 基因组原位杂交概述基因组原位杂交是一种使用特定的DNA探针与目标样本中的互补序列结合的技术。
该技术可以用于检测和研究细胞或组织中的特定DNA序列的位置和数量。
2.2 基因组原位杂交定义解释基因组原位杂交是一种利用DNA探针与靶标DNA进行配对结合，并通过适当的标记物（如荧光染料）来可视化或检测目标DNA在细胞核或染色体上的分布情况。
2.3 基因组原位杂交应用场景基因组原位杂交可广泛应用于遗传学、生物医学研究以及临床诊断等领域。
它常被用来检测异常基因重排、染色体缺失或增加以及指导癌症治疗等，具有非常重要的意义。
通过基因组原位杂交，科学家们可以确定某个特定DNA序列在细胞中的存在与否，甚至可以研究不同条件下DNA分子之间的相互作用。
这项技术对于理解基因组中的基因调控、染色体结构和功能等方面的研究具有重要意义。
原位杂交技术
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
原理：碱基互补配对原则
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原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
原位杂交实验注意事项
原位杂交实验注意事项原位杂交是一种常用的分子生物学实验技术，可以用于检测DNA序列在细胞或组织中的位置和数量。
在进行原位杂交实验时，需要注意以下事项：1. 实验前准备在进行原位杂交实验前，需要准备好所需的试剂和设备。
首先要制备探针，探针可以是DNA或RNA序列，必须与待检测序列有特异性结合。
同时还需要制备标记探针的荧光素或辐射性同位素等标记物质。
此外还需要准备组织切片、蛋白酶、去离子水等试剂。
2. 样品处理在进行原位杂交实验前，需要对样品进行处理。
对于组织切片样品，需要将其固定在载玻片上，并进行脱水和脱脂等处理步骤；对于细胞样品，需要将其接种到载玻片上并进行固定和透明化等处理步骤。
3. 探针标记探针标记是原位杂交实验中非常重要的一步。
标记探针可以使用荧光素或辐射性同位素等方法。
荧光素标记通常使用荧光素同工异构体，而辐射性同位素标记则需要使用放射性同位素。
在进行探针标记时，需要注意避免污染和误差。
4. 杂交反应在进行原位杂交实验时，需要进行杂交反应。
杂交反应通常在高温下进行，可以通过热板或烤箱等设备来实现。
在进行杂交反应时，需要注意控制温度和时间，并保持样品湿润。
5. 洗涤和检测完成杂交反应后，需要对样品进行洗涤和检测。
洗涤可以使用盐水、缓冲液等溶液来去除非特异性结合的探针。
检测则可以使用荧光显微镜或放射计等设备来观察样品中标记的探针。
6. 实验安全在进行原位杂交实验时，需要注意实验安全。
荧光素标记的探针具有一定的毒性，需要避免接触皮肤和吸入气溶胶；辐射性同位素标记的探针则需遵守相关放射防护规定，并严格控制实验室内辐射水平。
综上所述，在进行原位杂交实验时，需要注意以上事项，并严格按照实验步骤进行操作，以获得准确的实验结果。
原位杂交
原位杂交原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定：目的是(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl 处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交
DNA链。
3.寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变。 4.RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录 生成RNA。稳定性高、特异性强。
各种探针比较种类 来源 基因组某 一基因的全部 或编码序列 以mRNA为模板 反转录cDNA mRNA 优点 制备简单 不易降解 标记方法成熟 无内含子 缺点 非特异性杂 交 不易获得
证明，病毒的存在。 EB HBV HPV
３ 神经内分泌学：检查编码调节肽的mRNA,
确定激素的合成部位。
４ 病理学：癌基因表达。
５ 免疫学： Ag基因定位 ６ 发育生物学：基因的选择表达 原位杂交：mRNA （转录） 免疫组化：蛋白（翻译） ７ 其他：细胞外基质蛋白的来源。 胶原基因表达，Ig起源细胞
原位杂交
In situ hybridization
于 丽
一、概 述
Gall和Pardue于1969年建立。
应用于组织学、病理学、遗传学、微生物 学等多种生命学科。
检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA 序列。从基因水平认识疾病的本质，且在组 织细胞原位显示，有助于诊断或研究信息。
临床应用于病毒性疾病、遗传性疾病等。
A
C
B
D
原位杂交
(In situ hybridization ）
应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针
与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则
进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与
标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫
组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。
1.核酸分子杂交技术
单链的核酸分子在合适的温度和离
双链DNA
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
原位杂交和荧光定量
原位杂交和荧光定量
原位杂交是一种将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子的特点，应用带有标记的（放射性同位素、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA 的存在并定位。
荧光定量原位杂交技术则是一种分子遗传学实验技术，将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性-退火-复性-洗涤后即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
总的来说，原位杂交和荧光定量原位杂交都是一种在细胞或组织切片中定位特定核酸序列的技术，其中荧光定量原位杂交技术可以提供更多的定量和定性信息。
原位杂交技术
原位杂交技术一、概述（一）概念：原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization )的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。
是将分子杂交与组织学相结合的一项技术，也称之为杂交组织化学(hybridization histochemistry)、细胞杂交(cytologicalhybridization)或原位杂交组织化学(in situ hybridizationhistochemistry)。
（二）历史和现状可以检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA序列。
二、原位杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子(DNA , RNA)的碱基对形成氢键的互补性(A=T , A=U , C=G)，用一标记的核酸探针去检测与之碱基互补的靶核酸，这与免疫学中抗原－抗体的反应相似。
优点：①分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。
②既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。
③所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片。
④应用范围广泛，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。
三、探针(probe)是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。
用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。
（一）探针种类、来源和应用1. 双链cDNA探针2. 单链cDNA探针3. 寡核苷酸探针4. cRNA探针（二）探针标记的种类1.放射性标记2.非放射性标记最常用的为生物素(光敏生物素、补骨脂素生物素)和地高辛(digxigenin , DIG)，此外还有荧光素、酶类，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。
原位杂交技术
核酸分子杂交技术分子杂交是利用某些分子与另外的一些分子特异结合而形成结合体的过程，狭义指核酸分子杂交即具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。
根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。
1、固相杂交固相杂交即先将待测单链核酸样品结合到支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交。
固相杂交的特点：固相杂交后，未杂交的游离片段易除去，从而使膜上留下的杂交分子较易检测，并可有效避免靶DNA自我复性。
故固相杂交技术最为常用。
常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
2、液相杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。
液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。
液相杂交的特点：无需支持物。
待测核酸分子不用固定在支持物上。
其弊端是由于杂交后过量的未杂交探针存在于溶液中，在已有杂交结合物检测水平条件下检测误差较高。
故液相杂交在过去较少应用。
近年来由于杂交检测技术的不断进步，商业检测试剂盒的开发等液相杂交技术得到了迅速发展。
常用的液相杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交、复性速率液相分子杂交等。
3、原位分子杂交原位分子杂交实际上是固相杂交中的一种形式，杂交过程中待测DNA处于未经抽提的染色体之上，并在原位置上被变性成单链，与探针进行分子杂交。
原位分子杂交与其他杂交技术主要区别在于待测碱基序列位于染色体上。
其主要特点是可以准确定位目的DNA在染色体上的位置。
因此在分子遗传学研究、癌基因定位、遗传性疾病临床诊断方面具有重要而广泛应用。
下面做下具体介绍：1、菌落原位杂交●基本原理：菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
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(2) 3’末端标记 3’末端标记 5’—3’多聚酶 5’—3’多聚酶 3’—5’外切核酸酶 3’—5’外切核酸酶(dNTPs时,受抑制) 外切核酸酶(dNTPs时 受抑制) 适用于合成的寡核苷酸探针
3’末端标记效率高 3’末端标记效率高,杂交敏感性低 末端标记效率高, 5’末端标记效率低 5’末端标记效率低,杂交敏感性高 末端标记效率低,
3 寡核苷酸探针：PCR技术 寡核苷酸探针：PCR技术 10-50核苷酸 10-50核苷酸 其序列特异结合（靶基因序列）， 其序列特异结合（靶基因序列）， 且与无关序列不产生杂交反应。 且与无关序列不产生杂交反应。 优点：组织穿透性好，特异性强， 优点：组织穿透性好，特异性强， 稳定性好。 稳定性好。 缺点：灵敏性低（ 缺点：灵敏性低（短）
四、原位杂交的分类 1 核酸杂交的类型 液相杂交： 液相杂交：溶液中进行 固相杂交： 固相杂交：纤维素膜支持物上 斑点杂交 Southern Blot Northern Blot
2 根据所用探针和靶核酸的不同 DNA— DNA—DNA DNA— DNA—RNA RNA— RNA—RNA
3 根据探针标记物是否能直接被检测到 ISH可分为 ISH可分为： 可分为： 直接法：放射性， 酶， 荧光 直接法：放射性， 间接法：半抗原。 DIG， 间接法：半抗原。如DIG， Biotin
5 杂交反应
（1）dsDNA 和靶DNA变性, 加热95℃ 5-15min 和靶DNA变性 加热95℃ 变性, (2) 探针浓度: 0.5µg/ml (同位素) 探针浓度: (同位素 同位素) 2µg/ml (非同位素) (非同位素 非同位素) (3) 杂交液: 杂交液: 5×Denhart’s 液 2% SDS 50% 去离子甲酰胺 5×SSC 100µg/ml 鲑精DNA 鲑精DNA 10% 硫酸葡聚糖
4 cRNA 探针 目的基因cDNA片段插入含有特 目的基因cDNA片段插入含有特 异的RNA聚合酶启动子序列 聚合酶启动子序列（ 异的RNA聚合酶启动子序列（噬菌体 T7 or SP6）质粒中—扩增，纯化，酶 SP6）质粒中—扩增，纯化， 线形化— RNA聚合酶 聚合酶） 切—线形化— （RNA聚合酶） 体外 转录cRNA（ Probe） 转录cRNA（含标记物的 cRNA Probe） 应用： 应用：广泛 单链，无变性问题。 单链，无变性问题。 cRNA—mRNA杂交稳定 cRNA—mRNA杂交稳定 cDNA—mRNA） （较cDNA—mRNA）
2 引物延伸法（Primer extension） 引物延伸法（ extension） 3’-OH末端 3’-OH末端, 产量低 末端, 可标记纯度不太高的DNA 可标记纯度不太高的DNA
3 末端标记法(End-labeling) 末端标记法(End(1) 5’端标记 5’端标记 T4多聚核苷酸激酶 T4多聚核苷酸激酶
方法: 方法:层析法或沉淀法 1 层析法 小分子路途长， 小分子路途长，大分子物质先出 2 沉淀法 乙醇沉淀DNA RNA来纯化标记探针， 乙醇沉淀DNA和RNA来纯化标记探针， DNA和 来纯化标记探针 既方便，效果又好，比较常用。 既方便，效果又好，比较常用。 酚、氯仿抽提 乙醇沉淀 干燥 溶解分装冻存备用
二、原位杂交的基本原理
螺旋双链的DNA分子在碱性条件下加 螺旋双链的DNA分子在碱性条件下加 热至100℃(95℃ 98℃ 或加变性剂时， 热至100℃(95℃-98℃)或加变性剂时，其双 链间互补碱基的氢链解开而成为单链， 链间互补碱基的氢链解开而成为单链，此 过程称为变性 过程称为变性。 变性。
4 杂交前处理： 杂交前处理： 目的—提高组织通透性， 目的—提高组织通透性，防止非特异 脱蜡（充分） （1） 脱蜡（充分） 去污处理（Tritox—100） （2） 去污处理（Tritox—100）过度会引 起靶核酸的丢失， 起靶核酸的丢失，形态结构破坏 （3） Proteinase K 酸酐和酸处理(碱性蛋白变性, （4） 酸酐和酸处理(碱性蛋白变性,酶去 除降低背景) 除降低背景) 内源性酶，生物素去除： （5）内源性酶，生物素去除：减少非特 异性反应。 异性反应。
原位杂交是不经核酸提取的步骤， 原位杂交是不经核酸提取的步骤， 在组织细胞原位进行核酸杂交；再在 在组织细胞原位进行核酸杂交； 显微镜或电子显微镜下观察杂交信号。 显微镜或电子显微镜下观察杂交信号。
三、探针 （一）探针种类、来源和应用 探针种类、中获得 cDNA探针 反转录 聚合酶 分离mRNA 分离mRNA cDNA dscDNA 核酸杂交、 核酸杂交、结构分析 筛选目的基因（ 筛选目的基因（选出 含目的基因重组体克隆） 含目的基因重组体克隆） 扩增 提取质粒 纯化 酶切 纯化 标记
3 标本制备： 标本制备：
石蜡切片：保存形态结构好，敏感性低 石蜡切片：保存形态结构好， 冰冻切片： 形态结构较差， 冰冻切片：厚，形态结构较差，敏感性高 细胞涂片，贴片，爬片（细胞培养时）： 细胞涂片，贴片，爬片（细胞培养时）： 及时固定，容易有阳性结果， 及时固定，容易有阳性结果，同冰冻切片
防脱片：（石蜡切片） 防脱片：（石蜡切片） ：（石蜡切片 PLL （Poly-L-Lysine，多聚赖氨酸） > Poly- Lysine，多聚赖氨酸） APES （3’氨丙基三乙氧硅烷） > 明胶 3’氨丙基三乙氧硅烷 氨丙基三乙氧硅烷） 切片厚度: 切片厚度: 厚, 杂交位号多 5µm（石蜡） 5µm（石蜡） 10µm（冰冻） 10µm（冰冻）
五、原位杂交的基本步骤 杂交前处理—杂交反应— 杂交前处理—杂交反应—杂交后 处理— 处理—杂交体检测 检测DNA RNA，在取材， 检测DNA or RNA，在取材，固 定及标本制备方面有一些特殊要求。 定及标本制备方面有一些特殊要求。
1 取材：新鲜，尤其是RNA降解快， 取材：新鲜，尤其是RNA降解快 降解快， 要求30min内固定 内固定。 要求30min内固定。 2 固定：固定剂二大类： 固定：固定剂二大类： 交联固定剂:甲醛,戊二醛。 （1）交联固定剂:甲醛,戊二醛。保持 形态好，渗透慢。 形态好，渗透慢。 沉淀固定剂：甲醇，乙醇， （2）沉淀固定剂：甲醇，乙醇，丙 形态差，影响部分双链核酸。 酮。形态差，影响部分双链核酸。 首选4%多聚甲醛 亦可用10%缓冲 多聚甲醛， 首选4%多聚甲醛，亦可用10%缓冲 辐尔马林
这两条互补的核酸单链在一定离子浓度和逐 渐降温时， 渐降温时，其互补碱基间的氢链又可再连接而成 双链核酸分子，此过程称为退火或复性 退火或复性。 双链核酸分子，此过程称为退火或复性。 在退火或复性过程中， 在退火或复性过程中，如果加入外源且序列 互补的单链DNA或RNA片段 片段， 互补的单链DNA或RNA片段，则也可与原来解 开的一条单链互补连接而成异质双链核酸分子。 开的一条单链互补连接而成异质双链核酸分子。 这一合成异质双链核酸分子的过程称为核酸杂交 这一合成异质双链核酸分子的过程称为核酸杂交 或核酸分子杂交。 或核酸分子杂交。 如在加入的单链DNA或RNA片段上加以标 如在加入的单链DNA或RNA片段上加以标 记做为探针 探针(probe)， 记做为探针(probe)，则可显示出核酸杂交所形成 的杂交子而检出与探针互补的核酸。 的杂交子而检出与探针互补的核酸。
原位杂交
一、概述 二、基本原理 三、探针 （一）探针种类来源和应用 （二）探针标记的种类 （三）探针标记方法 (四) 标记探针的纯化 四、分类 五、基本步骤 六、注意事项 七、应用
一、概述
原位杂交（ ISH） 原位杂交（in situ hybridization ISH）是 应用生物化学的核酸杂交的原理，在组织切片、 应用生物化学的核酸杂交的原理，在组织切片、 细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或 细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA 序列的一项技术。 序列的一项技术。是将分子杂交与组织学相结 合的一项技术， 合的一项技术，也称之为杂交组织化学 (hybridization histochemistry)、细胞杂交 histochemistry)、 (cytological hybridization)或原位杂交组织化 hybridization)或原位杂交组织化 histochemistry)。 学(in situ hybridization histochemistry)。
4 体外转录法:制备RNA探针 体外转录法:制备RNA探针
表1 探针种类及常用探针标记方法 探针类型 双链cDNA 双链cDNA 单链cDNA 单链cDNA 寡核苷酸 单链cRNA 单链cRNA 标记方法 切口移位, 切口移位,引物延伸 引物延伸 末端标记, 末端标记,引物延伸 体外转录
(四) 标记探针的纯化 纯化:将标记反应未被化合的, 纯化:将标记反应未被化合的,即 游离的标记核苷酸与掺入cDNA 游离的标记核苷酸与掺入cDNA or cRNA的标记核苷酸分开 cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的 的标记核苷酸分开, 部分去除。 部分去除。
此技术最先由Gall和Pardue于1969年 此技术最先由Gall和Pardue于1969年 建立，以后广泛应用于组织学、病理学、 建立，以后广泛应用于组织学、病理学、 遗传学、微生物学等多种生命学科。 遗传学、微生物学等多种生命学科。它可 以检测组织细胞本身的或外源的DNA或 以检测组织细胞本身的或外源的DNA或 RNA序列 这一技术在病理学上， RNA序列。这一技术在病理学上，可使人 序列。 们从基因水平认识疾病的本质， 们从基因水平认识疾病的本质，且在组织 细胞原位显示，有助于诊断或研究信息。 细胞原位显示，有助于诊断或研究信息。 原位杂交技术经过30余年的发展完善 余年的发展完善， 原位杂交技术经过30余年的发展完善，目 前已开始从实验室走向临床， 前已开始从实验室走向临床，例如某些病 毒性疾病、遗传性疾病等。在某些医院， 毒性疾病、遗传性疾病等。在某些医院， ISH已作为一项常规技术得到应用 ISH已作为一项常规技术得到应用。 已作为一项常规技术得到应用。