逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
RT-PCR
适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有 PolyA 尾巴。）由于 Oligo dT 要结 合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少 量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。
RT－PCR
RT- PCR 即逆转录 PCR，是将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚 合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR 技术灵敏而且用 途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中 RNA 病毒的 含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。
中文名 逆转录 PCR 外文名 reverse transcription PCR 性质 聚合酶链式反应广泛应用的变形 模板 一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA oligo 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT
基因序列已知的情况。
3RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核苷酸 RNase：RNA 水解酶 PCR Buffer：RT-PCR 缓冲液 MgCl2：2价镁离子
(2) 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷 酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性 温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的 DNA 片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度 低3—5℃的条件下进行。
（3）PCR 扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷 贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦 PCR 反应进入几何级数 的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。 从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产 物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用 TaqDNA 聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶 序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想 情况。
逆转录-聚合酶链反应RT-PCRReverseTranscription-Polymerase
第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
No. of Cycles 1 2
No. Amplicon Copies of Target 2 4
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
PCR发明过程的简单回顾
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
变性 退火 延伸 90～97℃ 45～55℃ 72℃左右
PCR过程
一生二，二生四，四生万物
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火
PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸
历
1983.4 Kary Mullis 在 开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country 的 一 条被月光笼罩的山路上构 思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10,000$ 1993 Nobel prize
史
PCR?
• • • PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利· 穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概 念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的 技术，后者又上升成为新的概念。 …
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
引物决定了PCR产物的特异性 引物的设计应遵循一定的原则
DNA Replication PCR
解链方式
引 物
Topoisomerase
RNA primer
Heating
DNA primer
延 伸
反转录pcr原理及应用
反转录pcr原理及应用反转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转化为DNA并进行扩增的技术。
它利用酶逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA逆转录为互补的cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cDNA，从而实现对RNA表达的定量分析。
RT-PCR技术在分子生物学和医学领域中广泛应用，主要有以下几个方面：1. 定量分析RNA表达：因为RT-PCR技术可以将RNA表达量转化为cDNA扩增的数量，所以它可以用来定量分析基因在不同组织或条件下的表达。
2. 检测RNA病毒感染：RT-PCR技术可以用来检测病毒引起的RNA感染，如新冠病毒、HIV等。
3. 分析组织学标本：RT-PCR技术可以用于分析组织学标本中的RNA表达，如肿瘤组织中的癌基因表达等。
4. 检测基因突变：因为RT-PCR技术可以扩增含有突变的cDNA序列，所以它可以用来检测和鉴定基因突变。
5. RNA测序：RT-PCR技术可以用来预制RNA靶点，供后续RNA测序实验使用。
RT-PCR技术有多种不同的类型，它们的原理和应用有所不同。
以下介绍几种常见的RT-PCR技术：1. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR采用荧光探针实时检测PCR反应过程中扩增产物的数量，从而实现对RNA表达量的准确量化。
2. 反向转录-定量PCR（RT-qPCR）：RT-qPCR在RT-PCR的基础上，加入了荧光定量的测量方法，可以准确检测低浓度RNA样品中的表达情况。
3. 等温扩增RT-PCR：等温扩增RT-PCR是一种在恒定温度下进行的扩增，不需要特殊的PCR仪器，适合于在野外等条件下进行分析。
4. 数字PCR（dPCR）：dPCR是一种基于液滴PCR技术的扩增方法，可以用来检测少量RNA样品中的寡核苷酸序列。
虽然RT-PCR技术在RNA表达分析及临床应用方面有很多优势，但是这项技术也存在一些潜在的问题。
例如，使用PCR扩增技术时，可能会出现非特异性扩增产物，或者PCR抑制效应，这些都会影响数据分析的准确性。
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
检测mrna的方法
检测mrna的方法
检测mRNA的方法有很多种，以下是其中几种常用的方法：
1. RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）：这是一种常用的方法，通过将mRNA反转录成cDNA，然后进行PCR扩增，并使用荧光探针或染料检测目标mRNA的存在与否。
2. Northern blotting（北方杂交）：这种方法通过将RNA迁移至固定在膜上的DNA探针上，然后使用放射性探针或荧光标记的探针检测目标mRNA的存在及其大小。
3. In situ hybridization（原位杂交）：利用与目标mRNA互补的DNA或RNA 探针，在组织切片中直接检测mRNA分布。
4. RNA-Seq：这是最新的一种方法，通过高通量测序技术直接测定mRNA序
列和表达水平，可以提供全基因组范围内的mRNA信息。
这些方法各有优点和局限性，选择适当的方法取决于实验目的和研究对象的特点。
简述RT-PCR的原理及应用
简述RT-PCR的原理及应用1. RT-PCR的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成DNA并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的技术。
它结合了逆转录反应（RT）和PCR技术，能够从RNA分子中扩增出目标序列的DNA片段。
RT-PCR的原理可以分为以下几个步骤： - 逆转录反应：在逆转录酶（RT酶）的作用下，将RNA模板反转录成单链cDNA（互补DNA）。
- 第一链合成：通过加入一条适配器序列，形成一条新的DNA链，并使其保持单链状态。
- 第二链合成：加入第二个引物，依靠DNA聚合酶进行DNA链的合成。
此时，所得到的双链cDNA与原始RNA分子完全互补。
这样，通过逆转录和扩增两个步骤，我们可以从RNA模板中获得目标序列的DNA片断。
接下来，这些DNA片段可以通过PCR技术进一步扩增，以获取更多目标DNA。
2. RT-PCR的应用RT-PCR技术具有广泛的应用范围，包括以下几个方面：2.1 基因表达分析RT-PCR广泛应用于基因表达分析领域，其敏感性、特异性和快速性使其成为研究基因表达的重要工具。
通过从细胞中提取RNA，然后经过逆转录反应合成cDNA，最后通过扩增PCR得到目标基因的片段，可以定量分析目标基因在不同条件或组织中的表达水平。
2.2 病毒检测与诊断RT-PCR技术在病毒检测和诊断方面具有重要的应用价值。
病毒RNA是RT-PCR的理想模板，通过逆转录和扩增，可以检测病毒的存在和数量。
例如，在COVID-19大流行期间，RT-PCR被广泛用于检测冠状病毒的RNA，以诊断感染者和筛查潜在的传播者。
2.3 遗传疾病筛查RT-PCR也被广泛用于遗传疾病的筛查，特别是单基因遗传病的检测。
通过RT-PCR扩增目标基因的DNA片段，可以鉴定致病基因的突变。
这对于帮助家族中可能患有遗传病的个体进行早期诊断和咨询是非常重要的。
RTPCR的基本原理
RTPCR的基本原理一、什么是RTPCRRTPCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，常用于检测RNA的数量和序列特征。
通过该技术，可以对RNA进行逆转录合成DNA，然后利用聚合酶链反应（PCR）放大DNA的特定片段。
RTPCR技术在医学、生物学和疾病诊断领域具有广泛的应用。
二、RTPCR的基本步骤RTPCR技术主要包括逆转录、PCR放大和检测三个步骤。
1. 逆转录逆转录是将RNA转录为DNA的过程。
在逆转录过程中，需要使用逆转录酶、RNA 模板和引物（primers）进行反应。
逆转录酶能够将RNA模板中的核苷酸序列反转录成互补的DNA链。
引物是一小段DNA或RNA序列，在逆转录过程中与RNA模板发生互补配对，作为起始合成新DNA链的起点。
2. PCR放大PCR放大是将逆转录得到的DNA片段进行指数级扩增的过程。
在PCR反应体系中，需要加入逆转录产物、DNA聚合酶、引物和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）。
PCR 反应通过循环加热和冷却的步骤，在不同温度下引发DNA的分离、复性和扩增。
反复的PCR循环能够使目标DNA片段的数量成倍增加。
3. 检测PCR放大后的DNA片段可以进行进一步的检测和分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、荧光探针或荧光染料结合等技术。
通过这些方法，可以检测到目标DNA片段的数量和特异性。
三、RTPCR的应用RTPCR技术在医学和生物学领域有广泛的应用。
1. 疾病诊断RTPCR可以检测病原体的基因序列，用于疾病的早期诊断和追踪。
例如，在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情中，RTPCR被广泛应用于检测病毒的核酸，以帮助诊断和追踪病例。
2. 基因表达分析RTPCR可以检测和分析基因的表达水平。
通过检测特定基因的转录水平，可以了解基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达差异。
这对于研究基因功能和调控机制非常重要。
real-time rt-pcr的原理
real-time rt-pcr的原理
实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）的原理基于实时荧光定量PCR技术，结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个技术。
首先，通过逆转录将RNA转录成cDNA。
这个过程由逆转录酶和引物完成，
引物与目标RNA序列的特异性序列互补。
当引物与目标RNA序列结合时，逆转录酶开始参与反应，通过循环变化的温度条件，使RNA序列转录成互补的DNA（cDNA）。
然后，这个cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系中含有荧光探针和
引物，引物与cDNA的特异性序列互补。
当引物与cDNA序列结合时，通过循环变化的温度条件，使DNA片段扩增。
在PCR扩增过程中，荧光信号发生器被激活，荧光信号开始释放。
荧光信号的释放与DNA片段的扩增相关联，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA片段的扩增情况。
通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定初始样品中目标RNA的量。
总之，实时反转录聚合酶链式反应是一种高灵敏度、高特异性的RNA检测技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和基因突变研究等领域。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（RT
实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应 (RT姜红涛姚秀林抚顺市疾病预防控制中心，辽宁抚顺113006目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。
方法采用实时荧光定量RT-PC R及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法，同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。
结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份，实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份，χ2=8.1， P 0.005。
结论通过该实验，验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感，适用于实验室快速诊断。
教关键词实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应；细胞培养法；流感病毒R4 A 1674-074２（２０１5）03（b）－０192-02 姜红涛（1965-），女，天津人，本科，主管检验师，主要从事病毒检验工作。
2017年出现的流感病毒H7N9经自然重配，致病迅速，易变异，给人们带来极度恐慌，引起WH O 的高度重视，从而使流感病毒病原学的准确快速诊断显得尤为重要。
该实验室在2017年1月采用整群抽样法对抚顺市流感监测哨点医院的80份疑似流感样标本进行了实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（R T-PCR）法与细胞培养法进行了检测流行性感冒病毒的方法比较，现报道如下。
1资料与方法 1.1一般资料2017年1月在抚顺市国家级流感监测哨点医院，每周采集内科和儿科门诊就诊的流感样病例（体温≥38℃，同时伴有咳嗽或者咽喉疼痛等症状的急性呼吸道感染者）的咽拭子标本，放人pH7．4-7．6的DM EM采样液中，当日低温送流感实验室检测，每周采集20份流感样病例的咽拭子标本。
新冠病毒的快速诊断试剂与检验方法
新冠病毒的快速诊断试剂与检验方法新冠病毒（COVID-19）自2019年底以来迅速传播，成为全球关注的焦点。
快速且准确的诊断方法对于控制疫情、及时隔离患者和阻断传播链至关重要。
在病毒检测的进程中，快速诊断试剂和检验方法起着关键的作用。
本文将介绍新冠病毒快速诊断试剂和检验方法的最新进展。
一、快速诊断试剂1. RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是目前最常用的新冠病毒检测方法。
它通过提取病毒RNA，利用逆转录酶将RNA转录成DNA，再进行聚合酶链反应，扩增病毒基因片段。
RT-PCR具有高灵敏度和特异性，能够检测患者体内非常低水平的病毒载量。
然而，RT-PCR需要在专门的实验室条件下进行，并且需要几个小时的测试时间，不适用于大规模筛查。
2. 抗原快速检测抗原快速检测是一种新兴的检测方法，采用抗原检测试剂盒。
这种试剂盒可以直接检测新冠病毒的抗原，通常使用鼻咽拭子或唾液样本进行检测。
抗原快速检测具有快速、便携和高效的优点，可以在30分钟内提供结果。
它适用于初步的新冠病毒筛查和群体检测，但其灵敏度相对较低，可能会出现假阴性结果。
3. 抗体检测抗体检测是通过检测人体内新冠病毒感染后产生的抗体来确定感染情况。
抗体检测可以通过血清、血浆或其他体液样本进行，可以分为IgM和IgG两种类型。
IgM抗体在感染初期阶段产生，随后逐渐转为IgG抗体，持续时间较长。
抗体检测具有快速、简便和成本低廉的优点，适用于流行病学调查和免疫学研究。
但是，抗体检测在早期感染时的敏感度较低，并且不能直接检测病毒，仅能确定是否感染过病毒。
二、检验方法1. 核酸序列分析核酸序列分析是一种基于新冠病毒基因组的检验方法。
通过分离和提取病毒RNA，对其进行测序和分析，以确定感染者的病毒株类型、变异情况和传播链。
核酸序列分析对于疫情追踪、回溯和监测变异病毒株具有重要意义。
它可以帮助科学家了解病毒传播动态和病毒的演化过程。
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理一、 rt-pcr检测基因表达水平的基本原理1. rt-pcr技术是一种用来检测基因表达水平的常用方法，其中rt代表逆转录（reverse transcription），pcr代表聚合酶链式反应（polymerase ch本人n reaction）。
2. rt-pcr技术通过将RNA转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定基因的片段，从而检测基因的表达水平。
3. rt-pcr检测基因表达水平的原理可以分为逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
4. 逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用，RNA可以被转录成cDNA。
5. 聚合酶链式反应是将cDNA扩增的过程，通过聚合酶和引物（primer）的作用，cDNA可以被扩增成大量的目标片段。
二、 rt-pcr检测基因表达水平的具体步骤1. 提取RNA：首先需要从待检测的组织或细胞中提取总RNA，保证RNA的完整性和纯度对后续实验非常重要。
2. 逆转录：将提取的RNA进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶和随机引物或特异性引物。
3. pcr扩增：将逆转录后得到的cDNA进行聚合酶链式反应，使用特异性引物对目标基因进行扩增。
聚合酶链式反应的过程需要聚合酶、引物和dNTP。
4. 分析结果：最后通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法对扩增产物进行定量和分析，得到基因表达水平的信息。
三、 rt-pcr检测基因表达水平的优缺点1. 优点：rt-pcr检测基因表达水平的灵敏度高，可以检测低表达基因；检测结果定量化准确，能够得到基因的具体表达量；方法简单、快速、高效，适用于大规模的基因表达分析。
2. 缺点：需要严格控制反应条件和引物设计，以避免假阳性结果；受到RNA的完整性和纯度的影响，需谨慎处理RNA样本；无法区分剪接异构体，对于复杂基因的表达分析存在局限性。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告《RT-PCR实验报告》摘要：本实验旨在利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对特定基因进行定量分析。
通过逆转录将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
实验结果表明，该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
引言：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测、基因型鉴定等领域。
其原理是利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后利用PCR技术扩增目标基因，最终通过实时荧光信号检测目标基因的表达水平。
本实验旨在利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，为基因表达研究提供重要的技术支持。
材料与方法：1. 提取RNA：从细胞或组织中提取总RNA，使用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
2. PCR扩增：设计特异性引物，利用PCR技术扩增目标基因。
3. 实时荧光检测：利用实时PCR仪检测PCR反应过程中的荧光信号，得到目标基因的表达水平。
结果与讨论：实验结果显示，利用RT-PCR技术可以准确、快速地检测目标基因的表达水平。
与传统的Northern blot和原位杂交技术相比，RT-PCR技术具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，适用于大规模基因表达分析。
因此，RT-PCR技术在基因表达研究中具有广泛的应用前景。
结论：本实验利用RT-PCR技术对特定基因进行定量分析，结果表明该技术能够准确、快速地检测目标基因的表达水平，为基因表达研究提供了重要的技术手段。
未来，我们将进一步优化实验条件，扩大样本量，深入研究基因表达的调控机制，为相关疾病的诊断和治疗提供更多的理论和实验依据。
TR-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A )RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
RT-PCR与realtime pcr
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。
Real-time PCR 所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
Real time RT-PCR是将Real time-PCR的方法用于RT-PCR中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。
RT-PCR和Real time-PCR是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是Real time RT-PCR；也可以单独使用。
就是名称有点绕，逆转录PCR先出现，所以占用了RT-PCR这个简写，等Real time-PCR技术出现后，本来按照惯例，简写也是RT-PCR，但为了与逆转录PCR相区别，还是写成Real time-PCR。
rtpcr的常用方法
rtpcr的常用方法一、RT-PCR的基本原理1. 逆转录反应（Reverse Transcription, RT）：RT-PCR的第一步是将RNA转录成互补的DNA，这一步叫做逆转录反应。
逆转录反应通过引入RNA逆转录酶（Reverse Transcriptase）和随机引物（Random Primers），将RNA模板转录成cDNA（反转录DNA）。
2. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）：逆转录完成后，所得的cDNA经过稀释和变性等预处理后，使用DNA聚合酶（DNA Polymerase）和两个特异性引物，通过多轮的循环反应来扩增目标DNA区域。
二、RT-PCR的基本步骤1.RNA提取和纯化：从样品中提取并纯化RNA，以保证所得的RNA具有较高的纯度和完整性。
2.反转录反应：将RNA转录成cDNA，这一步可通过两种方式进行：使用随机引物、dNTPs、逆转录酶等直接反转录，或通过特异性引物（即RT引物）进行引物延伸。
3. PCR扩增反应：将逆转录所得的cDNA作为模板，使用特异性引物和DNA聚合酶进行DNA扩增。
PCR的循环条件通常是：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。
4.电泳分析：将PCR产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过对比分子量标准品，判断扩增产物的大小。
三、RT-PCR的优点和局限性1.优点(1)可以从一个RNA样本中扩增目标序列，从而可以检测低丰度的mRNA。
(2)推导出目标基因的相对表达量和定量结果。
(3)能够对基因表达的动态变化进行实时监测。
(4)扩增模板的选择性强，通过控制引物的设计，能够选择性地扩增特定的目标。
2.局限性(1)需要对RNA进行提取和纯化，这一步骤可能会引入一定程度的变异，影响结果。
(2)逆转录过程中可能发生评性引物引起的“板块效应”，导致不同通量的逆转录效率不同。
stem loop rt-pcr读法
文章主题：stem loop rt-pcr读法一、什么是stem loop rt-pcr？stem loop rt-pcr（stem loop实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测microRNA或其他小RNA的方法。
它通过结合stem-loop引物和反转录的特性，可以特异性地扩增microRNA序列，使其能够被实时荧光定量PCR检测。
二、stem loop rt-pcr的原理是什么？1. 引物设计：stem loop rt-pcr的引物结构包括两个部分，一个是stem-loop结构的引物，另一个是反转录的引物。
stem-loop结构的引物在扩增microRNA时起到特异性识别的作用，而反转录的引物则用于逆转录反应。
2. 逆转录反应：在逆转录反应中，stem-loop引物可以结合microRNA的3'末端，形成一个稳定的复合物，然后通过反转录酶进行逆转录反应，合成cDNA。
3. PCR扩增：逆转录反应后，利用所合成的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，通过检测荧光信号的强度，可以定量及时地检测到目标microRNA的表达水平。
三、stem loop rt-pcr的优势有哪些？1. 高特异性：stem loop rt-pcr的引物设计结构使其对microRNA具有高度的特异性，可以避免与其他RNA的交叉反应。
2. 高灵敏度：stem loop rt-pcr可以检测到非常低水平的microRNA 表达，具有较高的灵敏度。
3. 定量性：通过实时荧光定量PCR技术，可以对microRNA的表达水平进行定量分析，得到准确的数值结果。
四、stem loop rt-pcr的应用领域有哪些？1. 生物医学研究领域：在肿瘤领域，可以通过检测特定的miRNA表达水平来研究其在肿瘤发生发展中的作用；在生理学领域，可以研究miRNA在细胞分化、增殖和凋亡等生理过程中的调控作用。
2. 生物技术领域：在转基因研究中，stem loop rt-pcr可以用于检测和定量转基因作物中的miRNA表达水平。
逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。
二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。
在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。
逆转录聚合酶链反应
逆转录聚合酶链反应逆转录聚合酶链反应，简称RT-PCR，是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将围绕RT-PCR 的基本原理、操作方法和优缺点进行阐述。
一、RT-PCR的基本原理RT-PCR是一种将RNA转录成cDNA（即反转录）后进行的聚合酶链反应。
该技术主要包括两步操作，第一步是反转录，它利用逆转录酶将RNA模板转录成单链cDNA；第二步是PCR，它在单链cDNA模板上使用引物对特定区域进行扩增，最终得到双链DNA产物。
二、RT-PCR的操作方法下面是RT-PCR的具体操作步骤：1. RNA提取：从细胞或组织中提取RNA分子，可以使用商业化RNA提取试剂盒或自制方法。
2. 反转录：将RNA转录成单链cDNA。
这一步需要逆转录酶和引物的支持，随机引物和定向引物是两种常用的引物。
其中随机引物可用于反转录所有RNA分子，定向引物则需根据所需测定的RNA分子的序列和结构具体设计。
3. PCR扩增：使用引物对cDNA模板进行扩增。
PCR引物的设计应考虑引物的特异性和合适的引物长度。
4. 电泳分析：对PCR产物进行凝胶电泳，并根据分子量判断目标基因的表达情况。
三、RT-PCR的优缺点RT-PCR技术具有以下优点：1. RT-PCR技术可检测RNA分子的表达水平，具有较高的灵敏度和特异性。
2. 可以同时检测多个靶基因，适用于高通量分析。
3. 可以应用于小样本和低丰度RNA的检测。
4. RT-PCR技术操作简单，检测结果准确可靠。
而RT-PCR技术也存在以下缺点：1. 受RNA提取和反转录过程的影响，存在一定的技术误差。
2. 对待测样品的质量和纯度要求较高。
3. 一些反转录酶对RNA的选择性较差，可能存在对某些RNA分子的反转录不足。
总体来说，RT-PCR技术虽然存在一些缺点，但其优点意义重大，目前已广泛应用于医学、生物学、农业、环境科学等多个领域。
四、结语逆转录聚合酶链反应是一种重要的分子生物学技术，可以检测RNA分子在生物体内的表达水平，具有较高的敏感性和特异性，已在许多领域得到广泛应用。
实时定量RTPCR的原理及方法
实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。
该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。
本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。
二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。
这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。
实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。
反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。
这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。
然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。
在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。
实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。
这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成
cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
详细
实验方法
∙逆转录-聚合酶链反应实验方法
实验材料
∙组织或细胞样品
试剂、试剂盒
∙RNA提取试剂
∙dNTP 混合物
∙Taq DNA聚合酶
∙第一链cDNA合成试剂盒
仪器、耗材
∙离心管
∙离心机
∙水浴锅
∙PCR管
∙电泳仪
∙凝胶图像分析系统
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H
活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript
Ⅱ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
三、试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
四、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Pre amplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
①在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。
在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
②70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl；25mM MgCl22μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5min。
③加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
④于70℃加热15min以终止反应。
⑤将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
3．PCR：
①取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物（10 pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl）1μl。
②加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。
轻轻混匀，离心。
③设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
④电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
⑤密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
五、注意事项
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、
加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5．防止DNA的污染：①采用DNA酶处理RNA样品；②在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。