北师大版高中生物选修1：生物技术实践【实验】乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
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【实验】乳酸脱氢酶同 工酶的提取和分离
探究点 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验
蛋白质的提取和分离技术。
1．乳酸脱氢酶同工酶的提取 (1)取 5 g 新鲜的动物心脏，_漂__洗___干净后__剪__碎__到预 冷的玻璃匀浆器中，加入 25 mL__磷__酸__提__取__缓__冲____ 液，然后_冰__浴__研__磨__成匀浆(如图 1)。
(D )
谢谢
Hale Waihona Puke Baidu
放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量 ___T_B_E__电__泳__缓__冲___液(如图 3)。
(2)加样：取适量同工酶提取液与等量__载__样__缓__冲___液(质 量分数 40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取 20 μL 加入_样__品__孔___内。 (3)电泳：_1_0_0___ V 条件下电泳 30 min。 (4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到__凝__胶__底__部___时切断电 源，取出胶板浸入__染__色__液__中，37 ℃染色 15～30 min， 水洗后观察电泳结果。
3．结果分析
由图中电泳结果可以看出： (1)每个器官形成了_5_个条带说明_乳__酸___脱__氢__酶__有__5_种__同__工__酶__。 (2)LDH2 在_心__脏__中含量最高，在_骨__骼__肌___中含量最低，说明 ___不__同__的__器__官__同__一__种__同__工__酶__的__含__量__不__同____。 (3)骨骼肌中含量最高的是_L__D_H__5_，含量最低的是_L__D_H__1__， 说明__同___一__器__官__不__同__的__同__工__酶__含__量__不__同____。
(3)溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？ 答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应， 形成特殊的蓝紫色产物。 归纳提炼 1．实验步骤概括 取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→ 电泳→染色→冲洗→观察。
2．实验操作要点 (1)所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提 前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。 (2)蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混 匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重， 防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳 前沿指示剂，判断电泳的进行程度。 (3)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因 为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作 用下会向正极移动。
4．实验讨论 (1)提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保 持酶的活性？ 答案 酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)， 在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离 出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。 (2)制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了 保持酶活性而采取的措施？ 答案 ①提供必要的缓冲系统，以维持 pH 的相对稳定， 防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和 离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂， 导致酶变性，如对材料进行漂洗。
1．在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用
是
(B )
A．维持溶液浓度不变
B．维持溶液酸碱度不变
C．催化蛋白质分离过程顺利完成
D．无实际意义
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在
一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液 pH 的
影响，保持 pH 基本不变。
2．乳酸脱氢酶有几种同工酶 A．2 B．3 C．4 D．5 解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有 5 种。
活学活用
1．下列说法不正确的是
()
A．在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性
B．将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保
证酶的活性
C．载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维
持 pH 稳定
D．电泳的结果是出现了 5 个条带，说明乳酸脱氢酶
有 5 种同工酶
解析 酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此 在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研 磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载 样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置； 电泳出现了 5 个条带说明乳酸脱氢酶有 5 种同工酶。 答案 C
(2)将匀浆收集到冰浴的_离__心__管中，在__4_ ℃条件下 12 000 rpm 离心 10 min。吸取_上__清__液__，_4__ ℃条件 下保存备用(如图 2)。 2．琼脂糖凝胶电泳分离 (1)制备琼脂糖凝胶 用__T_B_E__电__泳__缓__冲__液配制质量分数为 1%的琼脂糖 凝胶，_加__热__溶__解___后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适 当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶
探究点 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验
蛋白质的提取和分离技术。
1．乳酸脱氢酶同工酶的提取 (1)取 5 g 新鲜的动物心脏，_漂__洗___干净后__剪__碎__到预 冷的玻璃匀浆器中，加入 25 mL__磷__酸__提__取__缓__冲____ 液，然后_冰__浴__研__磨__成匀浆(如图 1)。
(D )
谢谢
Hale Waihona Puke Baidu
放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量 ___T_B_E__电__泳__缓__冲___液(如图 3)。
(2)加样：取适量同工酶提取液与等量__载__样__缓__冲___液(质 量分数 40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取 20 μL 加入_样__品__孔___内。 (3)电泳：_1_0_0___ V 条件下电泳 30 min。 (4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到__凝__胶__底__部___时切断电 源，取出胶板浸入__染__色__液__中，37 ℃染色 15～30 min， 水洗后观察电泳结果。
3．结果分析
由图中电泳结果可以看出： (1)每个器官形成了_5_个条带说明_乳__酸___脱__氢__酶__有__5_种__同__工__酶__。 (2)LDH2 在_心__脏__中含量最高，在_骨__骼__肌___中含量最低，说明 ___不__同__的__器__官__同__一__种__同__工__酶__的__含__量__不__同____。 (3)骨骼肌中含量最高的是_L__D_H__5_，含量最低的是_L__D_H__1__， 说明__同___一__器__官__不__同__的__同__工__酶__含__量__不__同____。
(3)溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？ 答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应， 形成特殊的蓝紫色产物。 归纳提炼 1．实验步骤概括 取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→ 电泳→染色→冲洗→观察。
2．实验操作要点 (1)所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提 前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。 (2)蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混 匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重， 防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳 前沿指示剂，判断电泳的进行程度。 (3)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因 为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作 用下会向正极移动。
4．实验讨论 (1)提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保 持酶的活性？ 答案 酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)， 在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离 出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。 (2)制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了 保持酶活性而采取的措施？ 答案 ①提供必要的缓冲系统，以维持 pH 的相对稳定， 防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和 离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂， 导致酶变性，如对材料进行漂洗。
1．在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用
是
(B )
A．维持溶液浓度不变
B．维持溶液酸碱度不变
C．催化蛋白质分离过程顺利完成
D．无实际意义
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在
一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液 pH 的
影响，保持 pH 基本不变。
2．乳酸脱氢酶有几种同工酶 A．2 B．3 C．4 D．5 解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有 5 种。
活学活用
1．下列说法不正确的是
()
A．在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性
B．将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保
证酶的活性
C．载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维
持 pH 稳定
D．电泳的结果是出现了 5 个条带，说明乳酸脱氢酶
有 5 种同工酶
解析 酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此 在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研 磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载 样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置； 电泳出现了 5 个条带说明乳酸脱氢酶有 5 种同工酶。 答案 C
(2)将匀浆收集到冰浴的_离__心__管中，在__4_ ℃条件下 12 000 rpm 离心 10 min。吸取_上__清__液__，_4__ ℃条件 下保存备用(如图 2)。 2．琼脂糖凝胶电泳分离 (1)制备琼脂糖凝胶 用__T_B_E__电__泳__缓__冲__液配制质量分数为 1%的琼脂糖 凝胶，_加__热__溶__解___后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适 当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶