ELISA方法类型及原理

2.1 双抗体夹心法测抗原
酶标抗体
血清样品 或参比品
底物
特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关； 酶量与标本中受检物质的量成正相关；
2.2 双抗原夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。 检标本不需稀释，可直接用于测定， 检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对 高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法 高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法 HBsAg 。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不 本法关键在于酶标抗原的制备， 寻找合适的标记方法。 同，寻找合适的标记方法。
终止液
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
底物
传染病的诊断。 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒 例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒 ELISA
1.2
免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原， 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均
可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体， 可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此 抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免 抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原， 疫测定的应用范围极广。 疫测定的应用范围极广。
2.6 捕获包被法测抗体
加入稀释的 血清样品， 血清样品， 使血清中 血清样品或参比品 IgM抗体被 抗体被 固相抗体捕获 抗人IgM抗体连 抗体连 抗人 接在固相载体形 成固相抗人IgM 成固相抗人
终止液 底物
加入特异性抗 原与固相上的 特异性IgM结合 特异性 结合
特异性抗原
酶标抗体
加入特异性酶标 抗体， 抗体，使之与结 合在固相上的抗 原反应结合。 原反应结合。
辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； 酶标链亲和素（ ⑤：辣根过氧化物酶 酶标链亲和素 ）； 显色液； 显色； ⑥：DAB显色液；⑦：显色； 显色液 ABS：亲和素 亲和素(avidin)生物素 生物素(biotin)系统 系统(system） 亲和素 生物素 系统 ）
酶标仪测定OD值
加底物： 加底物：夹心式复合物中的酶催化 底物成为有色产物
终止液
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 、 等 只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 固相载体和制备酶结合物而建立此法 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA方法类型及原理 ELISA方法类型及原理
1、ELISA的原理 、 的原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。 是一种免疫测定（ 是一种免疫测定 ， ）。 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 产物的量与标本中受检物质的量直接相关， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性 或定量分析。 或定量分析。
2. 3 间接法测抗体
将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原； 将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；
样本稀释液 血清样品或参比品
加酶标抗抗体： 加酶标抗抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶； 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；
酶标抗体
加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。 形成固相抗原抗体复合物。
例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒
【试剂盒主要组成】 试剂盒主要组成】
1 包被抗原的检测板 2 阴、阳性对照血清 3 抗猪 抗猪IgG-HRP结合物 结合物 4 20倍浓缩洗涤液 倍浓缩洗涤液 5 底物 液、B液 底物A液 液 6 终止液 7 样品稀释液 8 血清稀释板 2块 块 各1管 管 1瓶 瓶 1瓶 瓶 各1瓶 瓶 1瓶 瓶 1瓶 瓶 2块 块 （96孔/板） 孔板 （1ml/管） 管 （20ml/瓶） 瓶 （30ml/瓶） 瓶 （10ml/瓶） 瓶 （10ml/瓶） 瓶 （50ml/瓶） 瓶 （96孔/板） 孔板

1.1
抗原抗体反应
1.1.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动 态平衡，其反应式为： 态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab Ag+Ab→Ag Ab
抗体的亲和力（ ），可以用平衡常数 表示： 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数 表示： ），可以用平衡常数K表示 K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与 值有关。高亲 的解离程度与K值有关 ／ 的解离程度与 值有关。 和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适 两者结合牢固，不易解离。 合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保 持原有的结构和活性。 持原有的结构和活性。
Hale Waihona Puke 2.4 竞争法测抗体血清样品或参比品 酶标抗体
终止液
底物
当抗原材料中的干扰物质不易除去， 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的 纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
2. 5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位 点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法 因此不能用双抗体夹心法进行测定， 模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原 标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与 模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与 固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的 固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多， 酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、 酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 的ELISA测定多用此法。 ELISA测定多用此法。 测定多用此法
1.1.3
最适比例
1.1.4
敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 水平; 化学比色法的敏感度为 水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10µg/ml; 酶反应测定法的敏感度约为 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相似； 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相似； 标记的免疫敏感度可提高数千倍， 水平; 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 水平 例如， 例如，HBsAg，其敏感度可达 ，其敏感度可达0.1ng/ml。 。
1.1.2
特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体 的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系， 的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系， 具有高度的特异性。 具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

组成】 【组成】 试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgG及其它试剂制成， IgG及其它试剂制成 试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgG及其它试剂制成，应用 间接ELISA原理检测猪血清中抗蓝耳病 蛋白的抗体 ELISA原理检测猪血清中抗蓝耳病N 抗体。 间接ELISA原理检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。 用途】 【用途】 猪蓝耳病ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。 猪蓝耳病ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。 ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病 评估猪场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。 评估猪场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。 【原理】 原理】 试剂盒是采用猪蓝耳病病毒N基因的基因工程表达产物包被检测板。 试剂盒是采用猪蓝耳病病毒N基因的基因工程表达产物包被检测板。在 试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝 试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后， 耳病N蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合， 耳病N蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗涤除去未结合 的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗， 的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗原抗体复合物发生 特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB底物液， 特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB底物液，与 TMB底物液 酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液中止反应后，用酶标仪630nm波长测定 酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液中止反应后，用酶标仪630nm波长测定 HF溶液中止反应后 630nm 各反应孔中的OD值。 各反应孔中的OD值 OD
2、ELISA的类型 、 的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 可用于测定抗原 方法中有三个必要的试剂： 方法中有三个必要的试剂： 免疫吸附剂" （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂 （immunosorbent）； ）固相的抗原或抗体， 免疫吸附剂 ） （2）酶标记的抗原或抗体，称为 结合物 （conjugate）； 结合物" ）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物 ） （3）酶反应的底物。 ）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 可设计出各种不同类型的检测方法。

2.7 ABS-ELISA法（亲和素 生物素系统 酶联免疫吸附试验） 生物素系统-酶联免疫吸附试验 法 亲和素-生物素系统 酶联免疫吸附试验）
固相支持物； 样品； ①：固相支持物； ②：样品； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； 生物素化抗小鼠 ）；
特异性IgG； ③：特异性 ；
加底物显色：如有颜色显示， 加底物显色：如有颜色显示， 则表示血清标本中的特异性 IgM抗体存在（阳性反应） 抗体存在（ 抗体存在 阳性反应）
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性 常和特异性IgG同时存在，后者会干扰 同时存在， 血清中针对某些抗原的特异性 常和特异性 同时存在 IgM抗体的测定。因此，测定 抗体的测定。 抗体多用捕获法， 抗体的测定 因此，测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清 抗体多用捕获法 先将所有血清IgM（包 （ 括特异性IgM和非特异性 和非特异性IgM）固定在固相上，在去除 括特异性 和非特异性 ）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性 后再测定特异性 IgM。IgM的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。 的检测常用于传染病的诊断， 。 的检测常用于传染病的诊断 尤其用于病毒性感染的早期诊断。