第十章 分析方法的建立与考察141205

①应用于新药体内研究(如药代动力学、生物利用
②应用于常规治疗药物监测的分析方法，则在具 有一定准确度和灵敏度基础上，应着重强调快 速、简便，以便及时为临床提供药浓数据。

分析方法的选择
一般而言，生物样品中被分析成分浓度高低是首要因 素，选择的分析方法具有的灵敏度必须与样品中药物浓度 相适应(几种分析方法的灵敏度比较见下图)。
第十章 分析方法的建立与质量控制
主要内容：
10.1 分析方法的选择和建立
10.2 仪器分析方法的方法学考察
① 提取条件的选定 ② 分离纯化 ③ 测定条件的选择 ④ 空白实验 ⑤ 标准曲线的制备 ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ 测定方法稳定性试验 精密度试验 重复性试验 检测灵敏度及检测下限的测定 回收率实验
10.1 分析方法的选择和建立
由此可初步获得以下信息：
①药物、代谢物和内标分离所需的色谱条件； ②合适的检测器和检测波长；
③药物、代谢物和内标进样量与响应值(峰高
或峰面积)的关系，大致了解最低检测量和所 需加入的内标量。

萃取条件的选择
药物等组份自蒸馏水中的萃取试验
选择合适的萃取方案时，可先考察组份自
蒸馏水中的萃取情况，具体方法是将几种组份

建立分析方法前应了解的内容
被分析物的主要理化性质（如药物的极 性、酸碱性(pKa)、溶解度、稳定性，以
及对光的吸收或荧光性质等 ）；

药物体内存在状况、体内代谢以及主要 药代动力学参数, 药物是否呈葡萄糖醛酸 结合物形式存在等；

分析方法应用的目的：
度 ) 的方法，不强调快速、简便，但要求有较 高的灵敏度和准确度；

色谱条件的选择
若分析的对象是药物和代谢物，则取药 物和代谢物纯品适量，若采用内标法定量， 还需取内标适量，分别将药物、代谢物和内 标用适当的溶剂溶解后直接进样，参照文献 或自行拟定的色谱条件进行层析。根据层析 情况，调整色谱参数或流动相组成，必要时 还应更换色谱柱，使药物、代谢物和内标在 色谱图上有合适的保留时间且峰形尖锐、对 称，并且各峰之间完全分离。
10.2 仪器分析方法的方法学考察 （1） 提取条件的选定

方法：
冷浸、热浸回流、索氏提取器提取、超声波提取等

提取液的取舍：
①取全量，即充分洗净残渣，并将洗涤液合并于提取液中； ②取一定量，即在提取前精密加入定量溶剂，称重，提取后， 再补充提取过程损失的溶剂，摇匀，过滤。精密吸取一定 量的提取液，进行含量测定，最后结果按相当的样品量计 算，即得。

提取条件的确定
—般要有不同溶剂、不同提取方式、不同 时间以及不同温度、pH值等条件比较而定，可
参考文献，重点对比某种条件，也可用正交试
验全面优选条件，再配合回收率试验或与经典 方法比较，从而估计方法的可靠性。
（2） 分离纯化
根据被测成分的性质，采用一定方法， 排除干扰物质，使供试样品达到一定纯净
③初步了解可测定的最低血浆药浓。

标准曲线建立与样品测定
当确定了合适的萃取条件和色谱条件之后， 可将定量的被测组份 (药物、代谢物)标准品加入 空白血浆中混匀，配制成一组(5～6个)呈梯度药 浓的标准血浆样品，若采用内标法定量，还应于 各份中加入等量内标，混匀后按照前面确定的预 处理方法和色谱条件分析，建立标准曲线，并同 时分析一批真实样品，为后面的分析方法评价积 累一些实验数据。
还应考虑各种分析方法的其他特点(如选择性)，
以及现有仪器、设备条件等，即应综合各方 面因素后确定应选择的分析方法。

分析方法的建立
各类分析方法的建立过程有一定差异。在
前面介绍的三类分析方法中，光谱法应用较少， 且前面已经介绍，而免疫分析法一般是使用商品 化的药盒，只要使用质量有保证的药盒并注意正 确使用，即可得到满意的分析结果。本章着重以 色谱法 (HPLC、GC) 测定血浆样品为例，说明 建立分析方法的主要步骤和应当注意的问题。
③初步了解被测组份的萃取回收率。
药物等组份自血浆中的萃取试验
将各组份(药物、代谢物和内标)同时加入 空白血浆中混匀使成一定浓度，然后按照前 面试验时确定的萃取方法和色谱条件作预处 理后进样分析，观察色谱图上的组份峰和杂 质峰情况。

通过上面被测组份自血浆中的萃取试验， 可获得以下信息： ①确定被测组份自血浆中萃取时合适的萃 取条件和分析时合适的色谱条件； ②考察被测组份自血浆中的萃取回收率；
(药物、代谢物和内标)共同溶于适量蒸馏水中， 使成一定浓度，在适当的pH条件下(如加入适量 缓冲液)用有机溶剂萃取。

通过组份自蒸馏水中的萃 取试验可获得以下信息： ①初步确定合适的萃取条件(萃取溶剂种类、 用量、水相 pH，以及挥干、浓集的条件 等)；②考察萃取过程中使用的溶剂、试剂 的纯度是否合适；
移植或改进现有文献方法— 此为经常面
临的任务，可参照文献报道的方法并根
据现有的实验条件直接引用，或只需稍
加改进后使用。

完全由分析工作者建立新方法
了解现有分析方法情况以供借鉴和参考， 查阅文献与熟悉文献是十分必要的。文献资 料除检索国内期刊外，便捷的方法可查阅分 析文摘(analytical abstracts)，可获得足够的 信息供参考。虽然建立一种全新的分析方法 尚无资料可供借鉴，但文献报道的其他化学 结构相近或主要官能团相同的药物，它们使 用的分析方法也可供参考
度。特别是气相、液相色谱分析更应注意
此点，以提高分析准确性并可保护色谱柱。
（3）测定条件的选择

如比色法、高效液相、薄层扫描法中最大吸
收波长的选择，液相色 谱法中固定相、流动 相的选择，薄层扫描Βιβλιοθήκη Baidu层析与扫描条件的选 择、高效毛细管电泳法缓冲液、毛细管柱、 电压的选择等。
(4)空白试验
在色谱法中常用阴阳对照法，即以被测成分或药 材与除去该成分或该药材 的成药作对照，可考察被测 成分的斑点(或峰)位臵是否与干扰组分重迭，以确证 测定指标(如吸收度、峰面积)是否仅为被测成分的响 应，防止假阳性的误判。紫外分光光度法或比色法中 的空白对照液常见的有溶剂空白、试剂空白(溶剂加显 色剂)，对复方制剂也须同色谱法做阴性对照，确证吸 收度仅为被测成分的响应。对单一成分或大类成分测 定，均须做此试验。
无论从人体或动物体内获得的样品，内含 药物浓度通常都很低，而可采取的样品量又很 少，供分析的样品量相应受到限制，加之一些
样品内药浓波动范围又很大，所以测定低药浓
样品时对分析方法的灵敏度要求较高。

目前生物药物分析中常用的分析方法有光谱 法、色谱法和免疫分析法等三大类。具体选 择分析方法时，除强调分析方法的灵敏度外，