聚磷菌的培养

聚磷菌的培养背景：污水中的磷和氮含量过高是造成水体富营养化的主要因素。

而其中的磷不像氮那样可以结合氧转化为气体，含磷的气态物质（PH3）又不易转化，所以污水除磷一直都用生物除磷法。

即用细菌等微生物来摄取水中的磷，达到除磷的效果。

而为了提高微生物除磷的效率、便于和其他材料协同使用，筛选、培养除磷细菌也是必不可少的工作。

培养菌种\菌落：聚磷菌（PAOs）菌落来源：废水除磷工艺中的活性污泥菌落组成：主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成；其中不动杆菌为主导细菌，除磷作用突出聚磷菌除磷机理：①好氧条件下，聚磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H3PO4结合，转化为ATP而储存起来。

细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所需，这一过程称为聚磷菌磷的摄取。

处理过程中，通过从系统中排除高磷污泥以达到除磷的目的。

②在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成ADP。

这一过程称为聚磷菌磷的释放。

聚磷菌除磷则就是通过以上两种过程完成的。

培养过程：1、材料准备1.1取样：从实验室运行稳定的厌氧\缺氧SBR反应器中，取富含反硝化聚磷菌的活性污泥做为实验样品。

1.2培养基配方：( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基（L1-）：蛋白胨10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；琼脂20 g ；p H 7.2 ，用于反硝化聚磷菌的分离、纯化( 2) 缺磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g ；Na2HPO4·2H2O 23 mg；CaCL2·2H2O 11 mg；NH4C1 152.8mg；MgSO4·7H2O 81.12 mg；K2SO4 17.83 mg；HEPES缓冲液7 g；微量元素)1( 2 mL；p H 7.2( 3) 富磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g；K2PO4 25mg；NH4C1 305.52 mg；MgSO4·7H2O 91.26 mg；CaC12·2H2O 25.68mg；PIPES缓冲液8.5 g ；2 m L 微量元素；p H 7 .2( 4 ) 硝酸盐还原产气试验培养基（L1 ）：牛肉膏3 g ；蛋白胨5g ；KNO3 1 g ；p H 7.4 。

2~4类培养基用于反硝化聚磷菌的筛选。

2、培养基制作2.1牛肉膏蛋白胨培养基A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

(牛肉膏可用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯)C先在上述烧杯中加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再将称好的琼脂放入已溶化的药品中，然后在石棉网上加热使其溶解、溶化。

（在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂）最后补足所失的水分到所需的总体积。

D 用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

（注意pH值不要调过头，以避免回调）E 将或加热融化后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部，再次高压灭菌，之后待其凝固即可。

（灭菌后的培养基要放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）F 检验合格的培养基编号待用。

可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久2.2缺磷培养基A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取各类药品。

先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种称量好的药品C 搅拌、适当加热使药品溶解，并加蒸馏水至所需体积D用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

（注意pH值不要调过头，以避免回调）E用滤纸过滤，直至液体培养基清晰便于观察即可F根据需要将培养基分装于各个三角烧瓶中，高压灭菌。

（灭菌后的培养基要放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）G检验合格的培养基编号待用。

可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久2.3富磷培养基同“缺磷培养基”2.4硝酸盐还原产气试验培养基A根据需要计算每个培养基所需要的药品质量B按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、KNO3放入烧杯中。

(牛肉膏可用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯)C搅拌、适当加热使药品溶解，并加蒸馏水至所需体积D 用滤纸过滤E根据需要将培养基分装于各个三角烧瓶中，高压灭菌。

（灭菌后的培养基要放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果）F 检验合格的培养基编号待用。

可放在4℃冰箱内保存，但是不宜存放时间过久2、菌株的分离、纯化、筛选2.1菌株的分离、纯化：A）取10m L污泥至装有90mL无菌水三角瓶中，加入玻璃珠，将三角瓶放入空气振荡器中，把污泥充分摇匀打碎。

B）打碎后的污泥经倍比稀释，在牛肉膏蛋白胨培养基上采用涂布平板法)2(分离、纯化)3(。

2.2菌株初筛：A）选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在缺磷的乙酸合成培养基中进行预培养（按分组）：先用1 mol／L的氢氧化钠将pH值调到7，然后各组培养物在30℃、140r／min的摇床)4(上过夜培养。

B）菌体细胞以10000r／min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于富磷培养基中（整个过程均在无菌操作台上进行），然后在30℃摇床中进行扩大培养，C）培养24h后，每组大约取10 mL菌液，滤纸过滤取澄清的无菌液体培养基，利用钼锑抗分光光度法测定接种后 3PO-P 含量的变化。

4D）取摄磷率高于50％的菌株分别进行硝酸盐还原产气试验)5(、异染颗粒染色)6(和聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色)7(试验。

既能过量摄磷又具有反硝化功能并有异染颗粒和PHB颗粒的菌株即为高效DNPAOs2.3*菌株复筛（本步骤是为了筛选耐低温的聚磷菌，若对低温没有要求则可以省去）：A）通过设置温度梯度的方法对各株菌进行降温驯化培养。

驯化培养过程按30℃一25℃一18℃一11℃一8℃温度梯度进行（模拟自然降温）。

B）接种采用10％梯度接种的方法，即：将上一梯度上培养48h的菌液取出10％接种于下一个温度梯度的培养基中，在恒温培养箱培养。

C）各菌在每个温度梯度上采用上述方法分别测定培养24h后的生长量、培养基中磷含量的变化。

D）将生长量受温度影响较小且除磷能力变化幅度较小的菌株选出。

这样的菌株就是耐低温高效DNPAOs。

3*、菌株鉴定（若只需要使用细菌，不需要研究特性，该步骤可以省略）将复筛中生长量受温度影响较小且除磷能力变化幅度较小的菌株选出。

通过电镜照片观察其单个细菌形态、细菌群落形状和颜色；测试其葡萄糖氧化特性、淀粉水解特性、酶水解特性等，结合《细菌鉴定手册》确定细菌种类。

4、扩大培养将复筛过程中选出的耐低温高效聚磷菌重新接种于培养基中，在恒温培养箱内进行扩大培养。

5、注释（1）微量元素混合液配方：取材（L1 ）：FeSO4·7H2O 40g；MnSO4·n H20 10g，A1C13·6H20 10g，CoC124g，ZnSO4·7H2O 2g，Na2MoO4·2H20 2g，CuC12·2H2O 1g，H3BO4 0.5g 。

溶解于5mol／L HC1溶液当中（2）涂抹平板法：先将培养基熔化后趁热倒入分好组的无菌平皿中待其凝固（培养基制作工序已完成），用无菌吸管吸取稀释了的菌液对号接种在不同编号的平皿或平板上，再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀。

将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养（可放在恒温培养箱内），至长出菌落。

（3）分离、纯化：初次用稀释液进行涂布平板法进行培养后，培养皿上的原稀释液中的单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，即不同培养基上会形成不同菌落。

取单个不同菌落制成悬液，重复涂布平板法分离数次，便可得到纯培养物，即培养基上只生长单种菌落。

分离出该类菌落并编号以便于筛选。

（4）摇床：这里所指的摇床是指在实验室使用的生物细胞培养摇床。

摇床通过摇动来培养微生物或细胞，同时进行温度和二氧化碳控制。

一般多为悬浮细胞培养。

它不但具备温度控制、湿度控制、二氧化碳控制功能，还具有光照控制以及高性能的保温密封功能及可消毒灭菌的功能。

（5）硝酸盐还原产气试验：准备甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）将细菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养1～2d；将甲、乙液等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，观察结果。

出现红色为阳性，即硝酸盐被还原，细菌具有反硝化作用。

（6）异染颗粒染色：可以购买专门的异染颗粒染色剂进行染色，也可以用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色（不呈蓝色而呈紫红色则证明有异染颗粒）（7）聚—β—羟丁酸(PHB)颗粒染色：苏丹黑B染色,PHB颗粒呈黑绿色材料制作整理：刘冬指导老师：刘德启。