甲壳素脱乙酰酶

甲壳素脱乙酰酶的研究进展摘要：甲壳素是一种天然含氮多糖类物质，脱乙酰基后生成壳聚糖。

由于其资源丰富、结构与性能独特而被广泛应用。

目前，壳聚糖的制备大多采用碱法使甲壳素脱乙酰基，由于此法所用碱液浓度高，反应时间长，产品质量不稳定，且对环境造成严重污染。

而采用酶法可以有效避免以上问题，且利用甲壳素脱乙酰酶的作用，可制备出具有高脱乙酰度且性能独特的壳聚糖。

关键词：甲壳素；脱乙酰酶；壳聚糖。

Abstract:Chitin is a kind of natural nitrogen polysaccharides material, acetyl off to create chitosan. Because of its rich resources, structure and performance of unique and widely used. At present, the preparation of chitosan is used mostly to take off the acetyl chitin exists, because this method used high concentration of lye, reaction time long, the product quality is not stable, and causing serious pollution to the environment. And the enzymatic can effectively avoid above problem, and the use of chitin deacelation enzyme function, can be prepared by a high deacelation degree and performance of the unique chitosan.Key words: chitin; deacetylase; chitosan.1. 甲壳素及壳聚糖概述甲壳素是1811年由法国学者布拉克诺(H. Braconnot)发现的，1823年由欧吉尔(A. Odier)从甲壳动物外壳中提取出来，并命名为chitin，译名为几丁质，又名甲壳质、壳多糖，化学名称为β-(1-4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4糖苷键连接起来的直链多聚物[1]。

甲壳素是一种天然存在的高分子多糖，广泛存在于甲壳类动物如虾、蟹、昆虫的外壳，真菌和植物的细胞壁中[2]。

甲壳素是自然界中存在的仅次于纤维素的第二大类生物材料，被科学界誉为"第六生命要素"、“动物纤维素”。

甲壳素呈晶体状态，几乎不溶于水和一般有机溶剂，这在很大程度上限制了其应用[3]。

壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的N-脱乙酰基形式，由于壳聚糖分子中有大量的游离氨基，分子带正电荷，化学性质活泼，易于对其进行各种化学修饰，并且可以溶于酸性及中性水溶液中，因而得到了十分广泛的应用。

例如用于污水处理，饮用水及饮料的澄清，食品的防腐剂、增稠剂、稳定剂，可降解包装材料，化妆品保湿剂，人造皮肤，手术缝合线，反渗透膜和超滤膜，酶的固定化载体，层析材料，药物缓释剂，赋形剂等。

另外，壳聚糖还有许多保健功能，可以作为膳食纤维添加到食品中，还可以降血脂，促进免疫球蛋白的产生，抗肿瘤，促进伤口愈合，促进骨胳生长等等。

2. 甲壳素脱乙酰酶（CDA）甲壳素脱乙酰酶（chitin deacetylase, E.C.3.5.1.41，以下简称CDA）是一种催化甲壳素中N- 乙酰基- D- 葡糖胺的乙酰胺基水解的酶[4]。

可以利用它代替现有的浓碱热解法生产壳聚糖，这不但可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，而且可以生产出某些用化学法不能生产的壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄的壳聚糖产品，以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖等，因此该酶还有重要的工业应用的潜在价值。

采用酶法进行脱乙酰化是一条既经济又行之有效的壳聚糖制备方法[5]。

2.1 CDA的来源自从Yoshio[6]最初于1974年在接合菌纲（Zygomycetes）的Mucor rouxii中发现CDA以来，Kauss等[7]于1982年又从半知菌纲（Deuteromycetes）的Colletotrichun lindemuthianum中发现该酶存在，这是首次从非接合菌中发现该酶。

以后在这2 纲中又陆续发现许多真菌可以产生CDA；包括：Mucor racemosus、Mucor miehei、Rhizopus nigricans、Absidia coerulae、Absidia glauca、Aspergillus nidulans、Colletorichum lagenarium、Fusariun solani、Fusarium oxysporum、Puccinia striformis等；另外，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中[8]以及无脊椎动物中[9]也有存在；甚至在感染了Colletotrichun lagenarium的黄瓜叶中也检出了CDA的活力[10]。

1998 年，Srin-ivasan 从市区废水中分离出一种未知菌, 这种菌能够将甲壳素脱乙酰化制成更为有用且易溶的壳聚糖。

通过细菌可以使甲壳素向壳聚糖的生物转化变得更为经济, 且不污染环境。

该细菌在大批发酵体系中比真菌更易生长，速度更快。

此外，该细菌可以无需纯化而被直接加以利用。

值得一提的是，在许多细菌中存在肽聚糖脱乙酰酶，由于肽聚糖的结构与甲壳素很相似，故肽聚糖脱乙酰酶对甲壳素也能表现出微弱的活性，这是需要与CDA区分的。

2. 2 CDA的分离纯化Kafet zopoulos D 等( 1993) 采用三步层析法对从真菌中提取得到的甲壳素脱乙酰酶进行了纯化，其纯化程度经聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测试为电泳纯[11]。

整个纯化过程总得率为11. 9%，纯化后甲壳素脱乙酰酶比活力为2. 9U / mg，纯化倍数为最初提取液的97. 3 倍。

mart inou A 等( 1993) 对Kafetzopoulos D 等的方法进行了改进，采用免疫亲和层析法对从Mucor roux ii 中分离得到的甲壳素脱乙酰酶进行纯化[12]。

经聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，纯化程度同样达到电泳纯，但整个纯化过程只需一步。

采用免疫亲和层析法提取的甲壳素脱乙酰酶表现出特殊的活性。

其比活力为13 U/ mg，且纯化总得率为30%。

活力及得率均大大高于传统的层析方法。

2.3 CDA的性能甲壳素脱乙酰酶对于甲壳素向壳聚糖的生物转化具有催化活性，其性质因来源不同而各有差异。

对从Mucor rouxii 中提取到的甲壳素脱乙酰酶的性质研究较多，该甲壳素脱乙酰酶的等电点很低( PI= 3) 表观分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳下测定约为75 Kda，在柱层析中测定约为80 Kda，这表明甲壳素脱乙酰酶是以单体形式存在的。

纯化后的酶经糖量分析，该酶是一种甘露糖含量较高的糖蛋白，糖含量达到约X= 30%。

研究还表明：该甲壳素脱乙酰酶对许多甲壳素类底物及甲壳素衍生物均具有反应活性，反应最佳温度约为50℃。

最佳pH 为4. 5，而且要求反应体系中至少存在4个以上N-乙酰氨基葡萄糖单元。

然而，当反应体系中存在羧酸( 尤其是醋酸) 时，催化反应受到抑制[11]。

从Col letotr ichum lindemuthianum 中提取得到的甲壳素脱乙酰酶是一种表观分子量约为150 Kda的糖蛋白, 其糖含量接近X= 67%。

该甲壳素脱乙酰酶同样对于许多甲壳素类底物及甲壳素衍生物具有催化活性。

但是，它不会因为羧酸( 特别是醋酸) 的存在而使反应受到抑制，而且表现出显著的热稳定性。

该酶反应的最佳温度约为50℃，最佳pH 值约为8. 5，反应中需要至少两个以上N - 乙酰基- D-葡萄糖单元[13]。

从Col letotr ichum lindemuthianum 中得到的甲壳素脱乙酰酶在催化反应的最佳pH 以及不被醋酸所抑制方面均表明，它与从Mucor roux ii 中提取的该酶有着明显不同的性质。

Kauss H 等认为这可能是因为甲壳素存在于真菌细胞壁外面，而该酶生长过程中在壁外参与聚合物的代谢[14]。

3. CDA酶促反应作用机理CDA的酶促反应即水解脱除甲壳素链上的N-乙酰基，制备壳聚糖。

研究表明CDA对不同底物作用的效率不同。

Martinou A等[15]对比了CDA对不同甲壳素底物的催化效率，发现脱乙酰效率顺序如下：羧甲基甲壳素＞甲壳素的脂肪族二元醇＞无定型甲壳素＞晶态甲壳素。

CDA的活性一般对甲壳寡糖高于长链多糖，对可溶性甲壳素衍生物高于结晶态甲壳素。

对此，Kafetzopoulos 等[16]解释为：甲壳素分子刚形成时，分子间未完全键合，因此CDA 易接近新生甲壳素分子的乙酰基团而起作用；一旦甲壳素结晶成微纤维状，CDA 难进入分子内部，故难以脱除乙酰基。

4.CDA 潜在的应用价值4.1 取代强碱热化学法生产壳聚糖目前，壳聚糖的生产采用的强碱法有三大缺点：一是耗能大；二是消耗大量强碱，且污染环境；三是产生的壳聚糖分子量及脱乙酰度不均一，多糖在热碱中易降解[17]。

而研究表明壳聚糖的脱乙酰度和乙酰基的分布对其物理化学性质和生物活性有较大影响，比如对金属离子的吸附能力、壳聚糖膜的张力、对酶的结合能力和免疫活性等[18]。

天然存在的几丁质是不溶性的结晶，CDA 直接作用无法起到很好的效果，如果将几丁质进行预处理，改变几丁质的结构，脱乙酰度能达到97％[19]。

更具意义的是来源于C.lindemuthianum的CDA可催化脱乙酰的逆反应，如利用部分脱乙酰的甲壳寡糖加上乙酰基合成3- 乙酰基壳聚糖四聚体，这是化学法难以比拟的[20]。

4.2 生物法直接合成壳聚糖在一些接合菌中，几丁质合成酶同CDA 一起合成细胞壁中壳聚糖[21]，在这类菌中，细胞壁中含有壳聚糖，并且有些真菌的壳聚糖含量及脱乙酰度均很高，如在M.rouxii 细胞壁中几丁质和壳聚糖的比为1：3，A.coerulae 中壳聚糖含量占细胞干重的8.4%，脱乙酰度高达95%[22]，可以直接利用它来发酵生产壳聚糖。

现已有人工合成壳聚糖的报道，脱乙酰度也高达71-74％。

4.3 生产特定乙酰化的壳寡糖M.rouxii 的CDA 在催化甲壳寡糖脱乙酰基时，会在寡聚三糖、六糖、七糖的还原端留下1 个乙酰基[23]；C.lindemuthianum 来源的CDA 在3.0M 乙酸盐存在的条件下可以逆向催化脱乙酰反应，将乙酰基加到壳聚寡糖的特定位置上，如在壳聚二糖的非还原端加上1 个乙酰基，成为β-D-GlcNAc-(1-4)-GlcN，在壳聚四糖的前3 个单体上分别加上乙酰基成为β-D-GlcNAc-(1-4)-B-D-GlcNAc-(1-4)-B-D-GlcNAc-(1-4)-BD-GlcN[24]，这些寡糖产品是很难用化学方法生产的。