血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响(一)

血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响(一)

作者：仲悦娇，陈宝安，黄成垠，李翠萍，高峰，费菲，裴孝平

【摘要】本研究探讨血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC）增殖和凋亡的影响。用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP，采用流式细胞术检测PMP的释放量，确定制备PMP时凝血酶的最佳应用浓度。以体外培养HUVEC为载体,通过噻唑蓝(MTT)实验和流式细胞术研究不同浓度的PMP对HUVEC增殖和凋亡的影响。结果表明，2、1.5、1.0和0.5U/ml凝血酶激活血小板后PMP的释放率分别为28.7、47.7、50.1和43.9%；HUVEC的增殖与PMP呈剂量依赖关系。在培养液中添加40μg/mlPMP时，HUVEC增殖是空白对照组的1.8±0.3倍；10μl/ml 血管内皮细胞生长因子（VEGF）组的HUVEC增殖是空白对照组的1.9±0.5倍，两组之间无统计学差异，（p>0.05）；PMP能抑制HUVEC的凋亡，40μg/mlPMP组的细胞凋亡率为（3.9±0.4）%,明显低于空白对照组的细胞凋亡率（9.4±0.5)%（p0.05）。VEGF（10μl/ml）对HUVEC细胞的凋亡无明显抑制作用,其凋亡率为（8.0±0.8）%。结论：用1U/ml的凝血酶刺激血小板释放的PMP较为均一，且释放量最大，可促进HUVEC细胞的增殖并抑制其凋亡。

【关键词】细胞凋亡

bilicalVeinEndothelialCells

DepartmentofHematology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China;1JiangsuPr ovinceBloodCenter,Nanjing210042,China

es(PMP)ontheproliferationandapoptosisofhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC).Differentc oncentrationsofthrombinwereadoptedtoactivatetheplateletssoastoreleasePMPs.Flowcytometry(F CM)wasadoptedtoevaluatetheefficienciesofdifferentconcentrationsofthrombintoreleasePMPs.By usingtheHUVECcultivatedinvitroasvector,theeffectsofPMPsontheproliferationandapoptosisofHUV ECwereinvestigatedbyMTTandFCM.TheresultsshowedthattheefficienciesreleasingPMPsfromplatel etsactivatedby2.0,1.5,1.0,0.5U/mlthrombinwere28.7,47.7,50.1and43.9%respectively;PMPsinduc edproliferationofHUVECinadosedependentmanner.Atthec oncentrationof40μg/mlPMPs,theprolife rationrateofHUVECwas1.8±0.3timesasmuchasblankcontrol,theproliferationrateingroupofvascular endothelialgrowthfactorwas1.9±0.5timesofasmuchasblankcontrol,therewasnostatisticdifference( p>0.05)paredwiththeapoptosisrateofcontrol(9.4±0.5)%，apoptosisrateinPMPgroup(40μg/ml)was(3.9±0.4)%(p0.05).TheadditionofVEGF(10μl/ml)didnotsuc cessfullypreventedapoptosisofHUVECwithapoptosisrateof(8.0±0.8)%.Itisconcludedthatplateletsac tivatedby1U/mlthrombingetsthebestefficiencyofPMPrelease,whichstimulatesproliferationofHUVE Candinhibitsitsapoptosis.

；humanumbilicalveinendothelialcell；proliferation；apoptosis

血小板衍生膜微粒（）是在血小板活化或降解过程中产生的直径为0.1-1.0μm的小囊泡颗粒，它含有多种特异性膜糖蛋白和生物活性受体，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应。研究表明，PMP可促进人造血干细胞、平滑肌细胞、骨细胞等的增殖。最近研究证实了血管生成因子（和VEGF）的水平与PMP水平有着很强的相关性〔1〕，PMP能刺激内皮细胞增殖、迁移并影响细胞形态〔2〕，促进血管生成的发生和肿瘤的转移〔3〕，PMP有促进伤口和溃疡愈合的功能，而且不同的血小板内复合物能调控血管生成的不同阶段。本研究通过PMP与人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)共同孵育观察PMP对HUVEC生长的影响。

RPMI1640干粉系美国Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，EDTA（二乙烯四乙酸二钠）溶液，MTT试剂为Fluka公司产品，血管内皮细胞生长因子（VEGF）为Sigma公司产品，流式细胞仪为BectobnDickinson公司产品，细胞凋亡检测试剂盒为BenderMedsystems公司产品，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

血小板膜微粒的制备

将血小板悬液经500×g离心10分钟（22±2℃），沉淀物悬浮于缓冲液中(9mmol/LNa2EDTA、26.4mmol/lNa2HPO4、140mmol/LNaCl),并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(137mmol/LNaCl、12mmol/LNaCHO3、5.5mmol/L葡萄糖、2mmol/LKCl、1mmol/LMgCl、0.3mmol/LNaHPO4)。调整血小板浓度为8×108/ml。分别采用2、1.5、1.0和0.5U/ml的凝血酶激活血小板（放37℃恒温摇床上振荡30分钟）。激活后的血小板（4℃，1600×g离心20分钟）,上清分离于另1试管中，于4℃，2700×g/min，离心1小时，并洗涤1次，沉淀物悬浮于Tyrode缓冲液中〔4，5〕。

PMP的鉴定及定量

用等量1％多聚甲醛固定PMP后采用CD61标记PMP,选择直径1μm的微粒以确定PMP直径阈值，并设定同型对照，用流式细胞仪分析不同浓度凝血酶作用后PMP释放的情况及PMP 制备的纯度。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PMP的浓度（以蛋白含量计），操作按试剂盒说明书进行。

HUVEC的培养

人脐静脉内皮细胞ECV304(引自中国科学院上海细胞生物研究所)接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液（含10%的小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）,于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每3-5天传代1次。传代时用0.02%EDTA消化8-10分钟，用培养液吹打制成细胞悬液，按1×105浓度接种。

PMP对HUVEC增殖活力的影响

取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×104/ml，接种于96孔培养板,100μl/well，实验组加入不同浓度的PMP，另外设空白对照和10μl/mlVEGF 组，每组设3个复孔。在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后,弃去培养液,加入5mg/mlMTT，10μl/well。继续培养6小时后,弃去上清液,加入二甲亚砜(DMSO)150μl/well,振摇10分钟,使结晶物甲月替（formazan）充分溶解,在酶联免疫检测仪上测定490nm处各孔的光密度值(OD值)，计算细胞增殖率。

PMP对HUVEC凋亡的的影响

取对数生长期的HUVEC，用含40μg/mlPMP的RPMI1640培养液制备成细胞悬液（2×104/ml），常规培养24小时；同时设10μl/mlVEGF组和空白对照组。将上述培养后的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，用冷PBS洗涤2遍，用50μl1×Annexin结合缓冲液悬浮细胞，加，室温避光放置10分钟，再加碘化丙锭（PI）10μl，混匀后室温避光放置5分钟，用冷PBS洗涤1遍，加300μl1×Annexin结合缓冲液重悬细胞后，立即在流式细胞仪上检测，以Annexin+/PI-判断为早期凋亡，Annexin+/PI+判断为晚期凋亡。