紫外可见分光光度计的使用.

紫外可见分光光度计基本原理及分析技术紫外可见分光光度计基本原理与分析技术

紫外可见分光光度计基本原理与分析技术

允许打印和进一步使用

原文来自Analytik Jena AG 2007版

翻译：汪素萍

目录

1 定义和基本原

理 (5)

1.1 光的吸收及光

谱 (5)

1.2 透射和吸

收 (6)

1.3 定性分

析 (6)

1.3.1 光谱与结

构 (6)

1.3.2 影响光谱的因

素 (7)

1.3.3 定性信

息 (7)

1.4 定量分

析 (8)

1.4.1 Lambert-Beer 定

律 (8)

1.4.2 标准曲线的绘

制 (8)

1.4.3 用于光度测量的样品制

备 (9)

1.5 动力

学 (9)

1.6 UV VIS 分光光度计的更多应

用 (10)

1.6.1 蛋白和DNA 分

析 (10)

1.6.2 DNA熔点测

定 (11)

1.7 导数光

谱 (12)

1.7.1 色度分

析 (13)

1.7.2 膜厚度的测

定 (14)

2 UV VIS 分光光度计的结

构 (16)

2.1 UV VIS 分光光度计的组

成 (16)

2.2 光

源 (16)

2.3 分光系

统 (16)

2.3.1 单色器系

统 (16)

2.3.2 多色器系

统 (17)

2.4 光谱带

宽 (18)

2.5 样品

室 (19)

2.6 检测

器 (19)

2.7 单/双光

束 (19)

3 比色

池 (20)

4 UV VIS 分光光度计的附

件 (23)

4.1 简单池架一览

表 (23)

4.1.1 应用：快速测试池用于牛奶中钙的测

定 (24)

4.1.2 应用：微量池和可调池架用于DNA 分

析 (24)

4.2 流通池测

量 (25)

4.2.1 应用：用流通池定量测定磷酸

盐 (25)

4.3 多联

池 (27)

4.3.1 应用：多联池用于酶动力

学 (27)

4.4 用于固体样品测定的附

件 (29)

4.4.1 固体样品架和反射附

件 (29)

4.4.2 应用：SPECORD ®透射测量法测定膜厚

度 (29)

4.4.3 应用：积分球用于牙齿表面白和黄指数的测

定 (30)

4.4.4 应用：防晒霜的测

定 (32)

4.5 光纤探

头 (33)

4.5.1 应用：ATR 探头用于颜料测

定 (33)

1 定义和基本原理

1.1 光的吸收和光谱

电磁辐射与固体、液体或气体的相互作用产生各种现象，比如吸收、反射或散射。UV VIS分光光度计是专用于研究紫外和可见范围内辐射与物质间相互作用的。

波长

波数

图 1 电磁辐射

当原子或分子吸收电磁辐射就会从基态转变为高能态的激发态，在这一过程中吸收特殊波长的能量。和原子相比，各种分子状态有着相当宽的能量范围。在红外

区受激，分子会转动和振动，而在可见和紫外区则可以通过价电子观察到特定能级(量子的吸收。

图 2：吸收和吸收光谱(抗坏血酸

这些量子的能量可以用辐射的波长来定义。波长越短，量子的能量越高。各吸收点的位置和相对的吸收值的大小可以用UV VIS 分光光度计测定。

1.2 透射和吸收

如果入射光的强度I 0 透过一个厚度为d 的介质，除反射和散射的损失外，光强度会因样品的特征吸收而减弱。此时的出射光(透射强度为I 。

图 3：透射

透射T 用以下公式定义：

或

样品的吸收值A 用以下公式表示：

（公式 1）

（公式 2）

和透射形成对比，溶液的吸收随光强度的减弱而增加。

1.3 定性分析

1.3.1 光谱与结构

来自分子吸收带的UV VIS 光谱通常是相对较宽的。和近红外光谱（产生许多窄带吸收）相比，提供的定性信息相对较少。有机分子在UV VIS 范围内的吸收通常通过生色基团 (颜色表现的种类产生。下表1中列出了各种生色基团及其最大吸收。

表1

生色基团

分子式实例

最大吸收

羰基-(酮羰基-(醛氨基2硝基2

丙酮乙醛乙酰胺硝基甲烷羧基醋酸氮氮键重氮甲烷如果使生色基团与另一个共轭，吸收带会先相长波方向位移。

1,5-己二烯（无共轭）

最大吸收185nm

1,3,5-己三烯（无共轭）最大吸收250nm

独特的环状不饱和烃在UV VIS 范围表现出非常有特点的吸收带。

图 4：苯蒸气的UV VIS光谱图

1.3.2 影响光谱的因素

对波长而言，精确值与特效取代基和溶剂二者有关。通常随着溶剂极性的增加，吸收光谱会发生蓝移(向短波方向；随着溶剂极性的减弱，会红移(向长波方向。

表 2

溶剂（极性逐渐增加）透射限于nm 处

n-（正）己烷氯仿二乙醚乙醇水

其他参数，比如pH 值和温度等，也会影响波长的位置和最大吸收强度。

1.3.3 定性信息

UV VIS 分光光度计可以给出以下定性信息：

z 纯物质的鉴定 z HPLC 分离后纯物质的鉴定（使用二极管阵列系统更合适）z 纯度测试（例如：蛋白质或DNA/RNA） z 蛋白和核酸的熔点曲线 z 饱和与不饱和化合物的识别 z 酮类和稀醇形态的识别 z 羰基带的鉴定 z 键合关系和取代效果的解析 z 酶活性

1.4 定量分析

1.4.1 Lambert-Beer 定律

Bouguer-Lambert-Beer 定律表达吸收和浓度的关系。 Bouguer （1696－1758）吸收值与光程长度成正比 Lambert （1728－1777）

Beer （1825－1863）吸收值与摩尔浓度成正比

（公式 3）

A(λ） - 吸收波长λ