酶分子的改造与修饰

第四章 酶分子的改造和修饰
改变酶特性的方法

1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天 然酶的活性。

2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而 达到改造酶的目的。
第四章 酶分子的改造和修饰
一、采用蛋白质工程技术修饰酶
1.基因修饰技术 （1）定位突变技术 （2）盒式突变技术 2.蛋白质工程修饰酶分子
第四章 酶分子的改造和修饰
易错PCR 技术

如：在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯 草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在 60%和85%的DMF中, 催化效率kcat/Ki分别是野生 酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行 两个循环的定向进化, 产生的突变体13M的kcat/Ki比 PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属 于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗 时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）.
第四章 酶分子的改造和修饰
酶分子体外定向进化原理
第四章 酶分子的改造和修饰
2. DNA改组

DNA改组又称有性 PCR(sexual PCR)


获得存在不同基因的正突变；
将正突变结合在一起形成新的突 变基因库； 从正突变基因库中分离出来的 DNA片段用脱氧核糖核酸酶Ⅰ 随机切割，得到随机片段； 随机片段经过不加引物的多次 PCR循环，随机片段之间互为 模板和引物进行扩增，直到获得 全长的基因，这导致来自不同片 段之间的重组。
条件：降低PCR中DNA复制的精确度 采用Taq DNA聚合酶 添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性） 替代Mg2＋（稳定非互补的碱基对） 调整4种底物的浓度使不平衡 （dATP/dTTP/dCTP/dGTP)
第四章 酶分子的改造和修饰
由于Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会 大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右； 加入dTTP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水 平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每5 个碱基对1个突变。 当然，错配率并不是越高越好，一般认为，理想 的突变频率为每个基因1.5~5个点突变。



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五、大分子结合修饰

大分子修饰(共价)的过程

修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如， 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、 环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构 和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基 团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可 以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修 饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行 修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分 子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。


第四章 酶分子的改造和修饰
DNA改组
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该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的 机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体.

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二、定向进化的应用
1.提高酶分子的催化活力 2.提高酶分子的稳定性 3.适应人工环境中提高酶活力或稳定性 4.提高读物转移性和增加对新底物催化活力 5.对映体选择性的定向进化 6.变换催化反应的专一性

第四章 酶分子的改造和修饰
1.基因修饰技术


（1）定位突变技术
蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密 码决定的，只要改变其中的第一、第二 个（或两个）就可以改变氨基酸。 噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在 噬菌体质粒中其基因组为单链，侵入宿 主细胞以后，通过复制以双链形式存在。 将待研究的基因插入载体M13，制得单 链模板，人工合成引物，合成相应的互 补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。 经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别 复制，因此就得到两种类型，含错配碱 基的就为突变型。再转入合适的表达系 统合成突变型蛋白质。

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亲和标记修饰

例如，对以芳香族氨基酸为特异的基质的胰凝乳 蛋白酶，用基质类似物的TPCK（L-1-甲苯磺酰 胺-2-苯乙基氯甲基酮）与之反应，则TPCK在苯 丙氨酸之侧链部分与胰凝乳蛋白酶进行特异的结 合，与氯化甲酮部分反应，这使在活性部分存在 的组氨酸残基有选择地烷基化。
酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。

定点修饰。
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四、亲和标记修饰

亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特定 基团发生作用，而不与作用部位以外的同类 或其它基团发生作用。
亲和标记修饰：借助亲和作用对目的分子进 行标记的方法。先将能与蛋白质亲和的分子 (如底物、抗原等)与目的蛋白活性部位特异 性、非共价键、可逆性结合，再通过具体的 化学反应使亲和分子上的活性基团共价结合 到活性部位附近的氨基酸残基上。


另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时， 其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力， 其稳定性也就增加了。
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五、大分子结合修饰


共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低 或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长 了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使 酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达 到原有酶活力的5.1倍
第四章 酶分子的改造和修饰
五、大分子结合修饰


非共价修饰
使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶 的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部 水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能 通过调节酶的微环境来保护酶的活力。

如半胱氨酸残基上的巯基可形成二硫键，碱性氨基酸残基 上的氨基和酸性氨基酸的羟基可形成盐基等。
若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则可能引 起酶蛋白空间结构的某些改变。这种修饰方法成为氨基酸 置换修饰。

第四章 酶分子的改造和修饰
氨基酸置换 化学修饰：难度大，成本高，专一性差，而且要对



第四章 酶分子的改造和修饰

进化酶基因测序结果表明共发生了7个碱基突变，其中3 个点突变引起了氨基酸的改变：Asn217Lys， Thr233Arg，Val367Gly（缬氨酸、甘氨酸）。 Thr（苏氨酸）位于亚基间相互作用的界面上，距离 Lys3271．5nm以内，推测突变后的Arg与底物α— COOH的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的 亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体．从而引起 了进化酶K m的下降和Kcat值的提高。
第四章 酶分子的改造和修饰
第一节 酶分子修饰 第二节 酶分子定向进化
第四章 酶分子的改造和修饰
第一节 酶分子修饰
一、采用蛋白质工程技术修饰酶 二、酶法有限水解 三、氨基酸置换修饰 四、亲和标记修饰 五、大分子结合修饰

第四章 酶分子的改造和修饰
限制酶大规模应用的原因


1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。

第四章 酶分子的改造和修饰
1.提高酶分子的催化活力

L天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马 酸和氨生成L-天冬氨酸。L-天冬氨酸在医药、食 品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨 酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一 步证实，在这种条件下通过酶的合理化设计来进一 步提高酶活力具有一定困难。为此，采用定向进化 的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。
第四章 酶分子的改造和修饰

根据定向进化的基本思想，确定了易错PCR→筛 选→(优势突变重组→筛选)n的实验路线。 共进行了4轮易错PCR，每一轮易错PCR约筛选 了3000个菌落。 最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。 对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果 表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶， 因此更适合于工业化生产L—天冬氨酸。



第四章 酶分子的改造和修饰

聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内 无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末 端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
天然超氧物歧化酶与经大分子修饰后的半衰期比较 酶 半衰期 6 7 min h 相对稳定性 1 70



天冬氨酸酶用胰蛋白酶水解，切去C端十多个氨基酸的肽 段后，活力提高4.5倍。
除去一部分氨基酸或肽段，可使酶的空间构型发生某些细 微的变化从而提高酶的催化能力。

第四章 酶分子的改造和修饰
三、氨基酸置换修饰

酶的催化能力极其稳定性主要依赖于酶的空间结构，酶蛋 白的空间结构主要靠副键（二硫键、盐键、酯键、疏水键 和范德华力等）来维持，而各个副键的的形成是由不同的 氨基酸所带基团决定的。
第四章 酶分子的改造和修饰
一、基本原理

在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有
3’→ 5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向 目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法， 选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。

定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于 环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化 而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制 下进行的

第四章 酶分子的改造和修饰
盒式突变

第四章 酶分子的改造和修饰
枯草杆菌蛋白酶是加酶洗涤剂中使用的主要蛋白水解酶， 由于它易于氧化失活，因此洗涤剂中添加的漂白剂大大降 低了该酶的效力。 这个酶活性中心Ser - 221 的邻位为Met222 ，由于 Met222 的存在，使该酶易被氧化失活，于是设法定点 突变，将此氨基酸进行取代。 但哪种氨基酸取代它最好，要求既要改善对氧化的稳定性， 又要不使酶活性降低。
天然SOD 右旋糖酐-SOD
Ficoll(低分子量)–SOD
Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
14
24 35
h
h h
140
240 350
第四章 酶分子的改造和修饰
第二节 酶分子定向进化p96
一、基本原理 二、定向进化的应用

第四章 酶分子的改造和修饰
酶分子定向进化

不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地 创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重 组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出 所需性质的突变酶。



于是采用盒式突变技术，每5 个氨基酸取代的质粒进行一 组实验，4 组实验就将其余19 种氨基酸分别取代Met 一222 ，得出最佳实验结果。
第四章 酶分子的改造和修饰
二、酶法有限水解

用适当的方法将酶蛋白肽链进行有限水解，既可保留或增 强酶的活性又可降低其抗原性，对蛋白酶的应用极为有利。 体内酶原的激活便是一种自发的有限水解修饰。在体外也 可使肽链水解，以达到修饰的目的。 例：胰蛋白酶原用蛋白酶修饰除去一个六肽，即可显示出 催化活力。
第四章 酶分子的改造和修饰
定向进化的选择策略
1.易错PCR 技术 2. DNA改组

第四章 酶分子的改造和修饰
1.易错PCR 技术
定义：从单一基因出发，通过改变PCR反应条 件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错 误而引起基因突变。 过程：双链DNA变性（解链；85－95℃） 引物与单链DNA结合（退火；50－ 70℃ ） 引物延伸（半保留复制；70－75℃ ）



第四章 酶分子的改造和修饰
1.基因修饰技术


(2)盒式突变技术
盒式突变1985年Wells提出的一种 基因修饰技术——盒式突变，一次可 以在一个位点上产生20种不同氨基酸 的突变体，可以对蛋白质分子中重要 氨基酸进行“饱和性”分析。 利用定位突变在拟改造的氨基酸密码 两侧造成两个原载体和基因上没有的 内切酶切点，用该内切酶消化基因， 再用合成的发生不同变化的双链DNA 片段替代被消化的部分。这样一次处 理就可以得到多种突变型基因。