宏基因组学

序列分析法
• 微序列技术 (Micr oarray)采用集约化和平面处 理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量 基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,从而形成 DNA 微矩阵 ,又称基因芯片。
• 焦磷酸测序技术( Pyrosequencing) 是在焦磷酸 盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反 应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行 整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100 倍 ,提高了测序的效率。
稳定性同位素标记技术
• 通过 SIP实验使参与特定代谢过程 (例如甲 烷氧化 )的生物基因组富集 ,克隆从 SIP实 验中获得的13C标记的核酸 ,从而构建一个 因吸收了特定的基质而在环境中执行特定 代谢功能的微生物宏基因组文库 ,这极大地 减少了需要筛选的克隆数量。
应用和研究现状
水体宏基因组学
焦磷酸测序技术
• 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光 反应。
• 原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶 的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一 次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释 放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸 测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测 序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸、 荧光素。
进行分析则极为困难。
功能筛选法
• 方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直 接检测 ；
• 方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突 变体在选择性条件下功能互补生 长的特性进行。
功能筛选法
• 以活性测定为基础 ,通过建立和优化 合适的方法从基因组文库中获得具有 特殊功能的克隆.
• 依赖于功能基因或编码功能蛋白在外 源宿主中的表达 。
土壤宏基因组学
• 从土壤宏基因组文库中获得新编码基因是该技术 的主要功能所在 ,已发现的新基因主要有生物催化 剂基因、 抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因
• 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物 催化剂的发现 , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon et al . , 2000 )、 蛋白酶、 氧化还原酶(Knietsch et al . , 2003)、 脂肪酶、 酯酶 ( Ki m et a l . ,2004; 2006)等 ,并且在此基础上获得新酶的许 多特征信息.
序列分析法
• 需要根据已知的基因和基因表达产物的保 守序列设计引物和探针，PCR是序列分析中 最常用的技术。
• 对鉴定新的基因成员有一定的局限性 ,但 它已被有效地用于鉴定系统发育学中的标 志基因(如 16S rRNA基因 )和带有高度保 守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、 葡 萄糖酸还原酶和腈水合酶等 ) 。
宏基因组学 研究现状和发展趋势
宏基因组学通过直接从环境 样品中提取全部微生物的 DNA, 构建宏基因组文库,利用基因组 学的研究策略研究环境样品所 包含的全部微生物的遗传组成 及其群落功能。
宏基因组学研究已渗透到各个 领域,包括海洋、 土壤、 热液Hale Waihona Puke Baidu、 热泉、 人体口腔及胃肠道等,并 在医药、 替代能源、 环境修复、 生物技术、 农业、生物防御及伦 理学等各方面显示了重要的价值。
为什么要研究宏基因组学呢？
• 99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微 生物世界的认识集中在不到1%的微生物上
• 人们对微生物的认识主要基于实验室纯培 养的单一微生物物种,对微生物群落作为整 体的功能的认识远远落后于对其个体的认 识
• 环境基因组学的研究方法
以基因组学技术为依托
主要的程序包括: 1、从环境样品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、将 DNA克隆到合适的载体中; 3、将载体转化到宿主细菌建立环境基因组 文库; 4、对得到的环境基因组文库进行分析和筛 选。
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关 系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中 的正确位置 。
• 优点：为筛选新的天然产物提供了 一种可选择的途径, 从中挖掘上百 万个新基因,揭示不可培养微生物 的代谢途径.
• 缺点：耗费大,需大量人力和物力。 与个体微生物基因相比,对序列片段
• 由于环境基因组的高度复杂性 ,需要 通过高通量和高灵敏度的方法来筛选 和鉴定文库中的有用基因。
• 筛选技术大致可分为4类:
第 1类基于核酸序列差异分析 (序列驱动 )；
第 2类基于克隆子的特殊代谢活性 (功能驱 动 )；
第 3类基于底物诱导基因的表达 ；
第 4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂 交在内的其它技术。
底物诱导基因表达法
• 代谢相关基因或酶基因往往在有底物存 在的条件下才表达 ,反之则不表达 ,SIGEX 即利用这个原理来筛选目的代谢基因。
底物诱导基因表达法
• 第一步：以 p18GFP为载体构建宏基因组文库； • 第二步：在无底物情况下以异丙基 —β2 D硫代半乳糖苷
( IPTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白 基因 ( gfp)表达的克隆子； • 第三步：在培养基中添加底物诱导代谢关基因的表达； • 第四步：根据 gfp基因的表达从宏基因克隆库中筛选出表 达代谢基因的克隆子 ,利用荧光激活细胞分离仪 ( FACS)从琼脂培养平板上将GFP表达的克隆子分 离出来。
• 宏基因组学
也称微生物环境基因组学, 环境基 因组学，元基因组学,生态基因组学。
环境基因组学建立在对疾病病因认识的基 础上 ,深入探讨环境胁迫 - 基因、 基因- 基 因间交互作用。其目标是研究环境胁迫对机 体遗传变异的过程和机理 ,包括发掘环境应激 和应答基因的多态性 ,探究这些多态性基因的 功能及其与患病风险的关系 ,其与毒理基因组 学密切相关 ,是在人类基因组基础上发展的功 能基因组学内容之一。
反应过程
• 脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)
DNA聚合酶↓（能和DNA模板的下一个碱基配对）
添加到测序引物的3’末端
↓ （释放）
焦磷酸(PPi)
ATP硫酸化酶↓加入 APS
特异的检测峰
↓
↗ （微弱光检测）
ATP→→→→氧化荧光素（产生可见光）
加入荧光素
序列分析法
• 鸟枪法测序 ( Shotgun sequencing)
• 海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供
了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 ,宏基因组学研究将大大促进人 们对它的认识。 • 极端环境水体 (如酸性矿水、 深海 )
由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生 物群落也较为独特 ；利用环境基因组学对其开展 微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应 的研究 ,将促进我们更好地理解这些极端环境生 态系统并对其加以调控和利用。