微生物实验论文

对α-淀粉酶的系统性研究

时有财，朱习爱，谭顺耀，李兴周

（云南大学 生命科学学院生命科学系 云南 昆明 650500）

摘要：α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。α-淀粉酶作用淀粉时可从分子内部切开α-1,4糖苷键，而生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称为α-淀粉酶。本文通过一系列实验，对α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性测定等七个方面的内容进行系统的研究，进一步加深了对该酶性质方面的理解，提高了实际操作能力。 关键词：α-淀粉酶，酶活力测定，发酵培养，酶提取，分离纯化

一、 α-淀粉酶酶活力测定 1.1碘比色法

1.1.1原理：酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测

淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）

1.1.2材料：碘原液，比色稀碘液，标准比色碘液，pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，2%可溶淀粉溶液，标准糊精溶液，标准终点色溶液，蒸馏水，相关玻璃仪器（试管、移液管、滴管）等。 1.1.3 方法：

发酵液（酶液） 2%淀粉液20mL+5mLpH6.0

缓冲液

预热60℃）

混匀、计时（保温60℃），反应开始

在白瓷板上定时取样（1滴）比色

比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）

代入公式计算酶活力单位

1mL 标准糊精液＋

混匀

标准比色管（红棕色）

对照比色

确定反应终点

1.1.4 计算公式

)/(485.0%22060mL t

N

N t μ=÷⨯⨯⨯=酶活力单位

ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成 Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间） 1.2 DNS 法 1.2.1原理：淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

1.2.2材料：3，5-二硝基水杨酸氢氧化钠；酒石酸钾钠；重蒸苯酚；无水亚硫酸钠，标准麦芽糖溶液，0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液，1%马铃薯淀粉溶液，麦芽糖，蒸馏水，相关玻璃仪器等。 1.2.3标准曲线的制作 相关试剂加入表： 试 剂 管 号

1 2 3 4 5 6

标准麦芽糖溶液 （m L ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水

（m L ） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0

麦芽糖含量 （m g ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 D N S 试剂

（m L ）

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

加入完成混匀后沸水浴5min ，定容至25mL 混匀比色。 1.2.4 酶活力测定步骤（流程）

1.2.5计算公式

N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min

1.3实验结果分析

将实验数据带入excel得到标准曲线方程：Y=0.545X-0.029

由方程和上式可计算出α-淀粉酶酶活力为500（u/ml）

蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×N

A280=0.4 A260=0.42代入上式得蛋白质含量为27（mg/ml）

比酶活力为18.52（u/ml）.

二、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化检测

2.1 基本原理

分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）；

分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落；

检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断；

同时可以结合糊化淀粉冷藏后变性透明度降低，淀粉酶扩散水解淀粉也会产透明圈。

2.2材料

马铃薯浸液，玉米淀粉，琼脂，可溶性淀粉，Na2HPO4 .12H2O，（NH4）2SO4 ，NH4Cl，豆粕粉浸出液，培养基，无菌吸管，无菌水，涂布器，CaCO3等。

2.3本次实验基本流程

2.4.1样品平板菌落计数结果（表一）

1 0.5 0.3 1.67 7

2 0.4 0.1 4 1 3

0.35

0.15

2.33

5

细菌总数 培养皿号 1

2

3

平均

1

2

3

平均

1

2

3

平均 1

2

3

平均 菌落数 无法计数 无法计数 59

61

75

65

56

7

5

23

CFU/g 3.25*108

菌落数

培养皿号 1

2

3

平均 1

2

3

平均 1

2

3

平均 1

2

3

平均 菌落数 0

2

1

3

2

CFU/g 1*108 产淀粉比例

30.7%