第四章(质粒载体)

EcoRI
Somastetin
BamHI
EcoRI
EcoRI
ligation
Lac-β-gal
pSomIII -3
somastetin
4．pUC质粒载体
• (1)pUC质粒载体的结构 • (2)pUC质粒载体的优点 • 第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 • 第二，适用于组织化学方法检测重组体 • 第三，具有多克隆位点MCS区段
pBR322质粒载体的构建过程
pBR322质粒载体的形体图
pBR322质粒载体的结构来源
pBR322质粒载体tet基因的插入失活效应
EcoRI pBR322
HaeⅢ λ
plac
HaeⅢ EcoRI
EcoRI EcoRI
HaeIII
Klenow
ligation
HindIII
pBH20 BamHI
Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码
有控制大肠杆菌素合成的基因
质粒分类
• 2）根据质粒的传递性
• 3）根据质粒的拷贝数
• 4）根据质粒和细菌的关系 • 4.质粒分布、大小和数目
二、质粒的基本特性
• • • • • • • • 1.寄生性 2．质粒DNA构型 3．质粒DNA编码的表型 4．质粒DNA的转移 5．质粒DNA的迁移作用 6．质粒DNA的复制类型 7．质粒的不亲和性 8. 其他特性
第四章 质粒载体
• 第一节 质粒载体概况 • 第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 • 第三节 质粒载体的构建 • 第四节 重要的质粒载体 • 第五节 质粒载体的稳定性问题
第一节 质粒载体的概况
• 一 质粒的定义、命名、分类、分布
• 二 质粒的基本生物学特性
• 三 质粒的分离与纯化
一、质粒的定义、命名、分类、 分布
• • (1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
1．氯化铯密度梯度离心法
• 2．碱变性法
• 3．微量碱变性法
• 4．影响质粒DNA产量的因素 • • (1) 寄主菌株的遗传背景 (2) 质粒的拷贝数及分子大小
分离纯化质粒 DNA的程序
寄主菌株的遗传背景
• 使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆 菌寄主菌株，
lac
Hha HindIII
EcoRI
EcoRI
HindII I pBH20 BamHI BamHI EcoRI ligation
lac
Hha HindIII
Samastetin BamHI
EcoRI
lac PstI
Hha HindIII
psomI
EcoRI Samastetin
BamHI
PstI Amp pBR322 EcoRI
诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主
控制的限制与修饰系统的基因等
4．质粒DNA的转移
• (1) 接合型质粒的自我传递 • (2) F质粒 • (3 )质粒DNA的接合转移 • • ①细胞交配对的形成 ②质粒DNA的转移
细菌的接合作用
• 在合适的条件下，雄性细胞和雌性 细胞混合培养，形成 雌—雄细胞配对过
•
(2)杂种质粒拷贝数的控制
Co1El、pSCl 01及其杂种质粒pSCl34的DNA复制
4．质粒复制控制的分子模型
• (1)抑制蛋白质稀释模型 • (2)自体阻遏蛋白质模型
质粒DNA复制控制的抑wenku.baidu.com蛋白 质稀释模型
质粒DNA复制控制的自体阻遏 蛋白质模型
第三节质粒载体的构建
• • • • •
•
1．天然质粒用作克隆载体的局限性 2．质粒载体必须具备的基本条件 3．质粒载体的选择记号 4．不同类型的质粒载体
(1)高拷贝数的质粒载体 (2)低拷贝数的质粒载体
•
• • •
(3)失控的质粒载体
(4)插入失活型的质粒载体 (5)正选择的质粒载体 (6)表达型的质粒载体
1． 天然质粒用作克隆载体的局限性
芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌—酿
酒酵母穿梭质粒载体。
大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体
第六节质粒载体的稳定性问题
• 1．质粒载体不稳定性的类型
• • • • • • • • • • • • • • (1)结构的不稳定性 (2)分离的不稳定性
2．影响质粒载体稳定性的主要因素
(1)新陈代谢负荷 (2)拷贝数差度 (3)寄主重组体系
质粒的基本生物学特性
• 1.寄生性 • 2．质粒DNA
•
(图4—1)
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
质粒DNA分子具有三种构型
• SC构型: 共价闭合环形DNA(cccDNA)， • 超螺旋的 SC构型； • OC构型: 开环DNA(ocDNA)，OC构型； • L构型: 发生双链断裂而形成线性分子 • (LDNA)，L构型。（图4－2）
lac PstI psomI
Hha Hind III
EcoRI Samaste tin BamHI
EcoRI PstI ligation PstI Amp pSomII
EcoRI PstI
EcoRI
Somastetin BamHI
PstI Amp pSomII
EcoRI
EcoRI Lac-β-gal
程为细菌的接合作用(conjugation)。
• 在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中
的F因子按滚环复制模式(rolling circle
replication model)，
(1) 接合型质粒的自我传递
• • 格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。 接合型的质粒(conjugative plasmid)，又叫自我转 移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外， 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
基因克隆质粒载体的三种组成
• • • • 复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点
二、构建载体的一般程序
• • • • • • 1.根据原则设计 2.分离纯化DNA片段 3.DNA片段连接重组 4.重组连接液转化 5.筛选重组转化子 6.载体的有关DNA序列分析
第四节重要的质粒载体
大肠杆菌F因子基因图
(3)质粒DNA的接合转移机制
• ①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编 码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立 配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。 ②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从 转移起点oriT开始的。
•
•
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去
了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力， 增进了质粒DNA分子的稳定性。
第二节 质粒DNA的复制与 拷贝数的控制
•
1．质粒DNA复制的多样性 2．ColEl质粒DNA复制的启动
•
•
•
3．质粒DNA拷贝数的控制
(1)天然质粒拷贝数的控制
•
• • •
(2)杂种质粒拷贝数的控制
pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图
丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形体图
5．其它重要的质粒载体
• • • • (1)丧失迁移功能的质粒载体 拥有较高水平的拷贝数 失去了bom位点，即便在共存的F质粒提 供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作 用。 • (2)能在体外转录克隆基因的质粒载体
•
非接合型的质粒(non—conjugative plasmid)，不能 自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。
(2)F质粒
•
又叫F因子(ferti1ity factor) ，单拷贝的接合型质粒， 其分子量约为94kb，共编码19个转移基因(tra)。F质粒 有三种存在方式： • (i)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带 有染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。 • (ii)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时还携 带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’ 细胞。 • (iii)以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色 体上，这样的细胞叫做Hfr细胞(高频重组细胞)。
环 形 双 链 质 粒 分 子 的 三 种 构 型
DNA
质粒DNA的分子构型 质粒DNA琼脂糖 凝胶电泳模式图
(a)
(b)
OC L
SC
3.质粒DNA编码的表型
• 质粒DNA编码的基因有产生抗菌素的基因、 芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒 素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、
• 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，
4．质粒复制控制的分子模型
(1)抑制蛋白质稀释模型 (2)自体阻遏蛋白质模型
质粒DNA的复制与拷贝数的控制
• 1．质粒DNA复制的多样性 • (i) 对寄主酶的依赖性 • (ii) DNA聚合酶的利用 • (iii) 复制的方向性 • (iv) 复制的终止 • (v) 复制型
• 2．ColE1质粒DNA复制的启动 • 3．质粒DNA拷贝数的控制 • (1)天然质粒拷贝数的控制
pSP64质粒载体的形体图
pSP64与PSP65质粒载体的多克隆位 点区的核苷酸序列结构
(3)穿梭质粒载体
• 穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)， 是指一类由人工构建的具有两种不同复
制起点和选择记号，在两种不同的寄主
细胞中存活和复制的质粒载体。
•
穿梭质粒载体，有大肠杆菌—枯草
1．pSCl01质粒载体
2．CoEEl质粒载体
pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因
3．pBR322质粒载体
• (1)pBR322质粒载体的构建 • (2)pBR322质粒载体的优点 • 具有较小的分子量 • 具有两种抗菌素抗性基因可供作转 • 化子的选择记号。 • 具较高的拷贝数 • (3)pBR322质粒载体的改良
7．质粒的不亲和性
(1) 质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础
8.质粒的其他特性
• 稳定性：维持一定的拷贝数
• 同源性：不同的质粒有相同的同源区
• 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 • 消除和恢复性等特性
三.质粒DNA的分离与纯化
• 1．氯化铯密度梯度离心法 • 2．碱变性法 • 3．微量碱变性法 • 4．影响质粒DNA产量的因素
• 一.大肠杆菌质粒载体 • 1．pSCl01质粒载体
•
•
•
2．Co1E1质粒载体
3．pBR322质粒载体
•
•
4．pUC质粒载体
5．丧失迁移功能的质粒载体
6.能在体外转录克隆基因的质粒载体
一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图
二、酵母菌质粒载体（穿梭质 粒）
• • • • • • １．酵母2µ 质粒 ２．乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 ３．大肠杆菌－酵母穿梭质粒 ４．酵母表达型质粒 ５．酵母分泌型表达质粒 ６．酵母人工染色体－YAC
• 定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立 于染色体外的自我复制并稳定遗传的环 状双链DNA分子。 • 命名：小写字母p代表质粒，两个大写 字母代表发明者，后接实验编号， • 分类： • 分布：
1）根据质粒的性状特征
①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 ②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，
3．质粒载体的选择记号
• 在基因克隆中采用的质粒载体的选 择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌 素E1 的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗 菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉 素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等
正选择质粒载体PKN80的形体图
4．不同类型的质粒载体
• (1)高拷贝数的质粒载体 • (2)低拷贝数的质粒载体 • (3)失控的质粒载体 • (4)插入失活型的质粒载体 • (5)正选择的质粒载体 • (6)表达型的质粒载体
大肠杆菌F质粒转移区结构--该区编码着控制细胞接合作用的基因
质粒DNA的接合转移及复制
5．质粒DNA的迁移作用
• 共存的接合型质粒引发的非接合型 质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。
F因子带动Co1E1质粒转移的条件
6.质粒的复制类型
• 两种不同的复制型： • “严紧型” (stringentplasmid)； • “松驰型” (relaxedplasmid)。 • 质粒拷贝数的定义： • 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA • 分子的数目
• 天然质粒有 Co1E1、RSF2124和
PSCl01等。天然质粒的局限性：如质粒
的分子量较大，拷贝数较低，只有一个
抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技
术选择重组体分子等。
2．质粒载体必须具备的基本条件
• (i)具有复制起点 • (ii)具有可选择的标记
• (iii)具有若干限制酶单一识别位点
• (iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数 • (v)作为表达载体还有启动子，转录转移信号， 终止子序列等片段。