基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术

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(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

基因工程菌发酵及相关技术交流

基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。

比如规模小，控制更精确，产物易失活等。

工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。

经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。

这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。

2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。

3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。

4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。

高密度发酵概述

5、培养温度
• 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵, 低温培养能提高重组产物的表达量。一般大肠杆菌的最适生长温度是37 ℃, 而质粒稳定温度和目标蛋白的诱导温度大多为30℃。
• 对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌, 发酵过程一般分为生长和表达两个阶段, 在不同培养阶段采用不同的培养温度
3、溶氧浓度
• 溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。
• 在高密度发酵过程中提高溶氧量的方法主要有：增大搅拌转速；增加空气流量以增加溶氧量；通入纯氧来提高氧的传递水平；培养基中添加H2O2，利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O2；提高氧的分压。
二、实现高密度发酵方法
• 主要有：(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6) 后处理过程的优化。
一、影响因素
• 1、培养基的选择培养基分为天然、组合和半组合培养基3
种。高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物, 一般使用的培养基为半组合培养基。培养基各组分的浓度和比例要恰当, 过量的营养物质反而会抑制菌体的生长, 特别是碳源和氮源的比例。
2、接种量
• 接种量的大小直接影响发酵周期。接种量小( 0.5 %～4 %) 时, 比生长速率大, 对数生长期持续时间长; 接种量大( >8 %) 时, 细菌较快地达到了稳定期, 持续生长时间短, 自溶也较快, 所以接种量一般选择在4 %以下。
• 诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。

第七章基因工程菌的发酵生产

生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体（2）选择适宜的培养方式（3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件（4）固定化技术
生物工艺学第二节基因工程菌的培养工艺培养基的组成与培养条件碳源氮源无机盐生长因子营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分接种量
生物工艺学
院系：生物医药系教研室：生物工程
北京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制溶解氧对发酵的影响及其控制菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商泡沫对发酵的影响及其控制发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范（1）接种（2）机械密封（3）取样（4）排气（5）排液基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义基因工程菌特点基因工程菌质粒的不稳定影响质粒稳定性的因素提高质粒稳定性的措施基因工程菌培养基的组成与培养条件基因工程菌发酵的工艺过程质粒稳定性的分析实现高密度发酵的方法基因工程菌发酵过程的检测与控制基因重组菌外漏的防范基因工程产物的提取

植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵

维普资讯
第２１卷第３期
２００２பைடு நூலகம் ９月
大连轻工业学院学报
ＪｕｎｌｆＤａｉｎＩｓｉｕｅｏｇｔＩｄｓｒｏｒａｌｎｔｔｆＬｉｈｎｕｔｙｏａｔ
Ｖ０．１１２．Ｎｏ３．
中图分类号：７６Ｑ８
文献标识码：Ａ
ＨｉｈｄｎｉｙｆｒｅｔｔｏｆｒｃｍｂｉｎｔｐｒｄｃｎｇｅｓｔｅｍｎａｉｎｏｅｏｎａｏｕｉｇｐｔｓｃａｐｓｏｉｈｙａｅＰｉｈｉａｔｒｓ
ｖｇｕｃｉｖｄ４．ｉｏｒａｈｅｅ１× １Ｕ／０ｍＬ．
植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，一种优良的食品和饲料添加剂，消除单胃是可动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，高提机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，有良具好的饲喂效果，同时，低了磷对环境的污染。国降外对植酸酶的研究已有３０多年的历史ｕＪ但由，
艺稳定，酵周期可缩短一半以上，菌体产量和发而产物表达量是非高密度发酵的ｌ～５００倍，白活蛋性提高２～３倍，可见高密度发酵具有无法比拟的
优点［Ｊ加。本文作者利用Ｖｉｉｒｓ白控发酵罐，本ｔ对实验室构建的一株巴斯德毕赤酵母的植酸酶工程菌Ｇ１５ｐｙｓ１／ｈＡ１行补料分批（ｅｄＢｔ）Ｉ进Ｆｅａｃ培ｈ养，得了较高的菌体密度，高了该系统的表达获提

基因工程菌发酵

基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、 γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
1、基因工程菌的组建
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。
平板培养基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次,计算比值
(稳定性stability)
4、影响质粒稳定的因素
• 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对
其稳定性的影响； • 宿主对质粒稳定的影响； • 质粒拷贝数；
• 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。
5、使质粒稳定的措施
组建合适载体选择适当宿主施加选择压力

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶余玉奎;桂馨;李平;李敏【摘要】为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-pET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-pET21a液体深层发酵的培养基.50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、pH控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量.通过优化发酵过程控制pH和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/mL,达到摇瓶培养的10.1倍.研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2018(048)002【总页数】6页(P29-34)【关键词】L-抗坏血酸-2-葡糖苷;维生素C;大肠杆菌;液体深层发酵;诱导剂【作者】余玉奎;桂馨;李平;李敏【作者单位】同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092;同济大学生命科学与技术学院,上海200092【正文语种】中文维生素C(英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸)作为酸性药剂、还原剂、抗氧化剂、漂白剂以及化学反应物、食品和饮料中的稳定剂[1]，广泛应用于化妆、保健、医药、食品行业。

在医疗卫生方面，维生素C参与许多新陈代谢过程，具有提高人体免疫力、抗衰老、预防心血管、增加对感冒抵抗力、促进胶原蛋白的合成[2]、抑制癌细胞增殖[3],防治坏血病和传染病、促进创伤愈合等作用，是辅助治疗的保健药品[4]。

在化妆品中，维生素C可作为还原剂、紫外线吸收剂和黑色素形成抑制剂来使用[2]。

具有美白皮肤、预防色斑、抗氧化功效。

由于人体内缺乏古洛糖酸内酯氧化酶，不能自身合成维生素C，必须靠体外摄取[5]。

因此，维生素C被列为人体的必需营养元素，在保护人类健康和生长过程中起到不可替代的重要作用[1]。

生化工程-基因工程菌培养

生物制药的挑战
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物，使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有害物质或重金属离子，降低对环境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白质或代谢产物。

IGF—I工程菌的高密度发酵与工艺优化

发酵科技通讯
第３９
Ｉ — 工程茵的高密度发酵与工艺优化ＧＦＩ
陈蔚青陈虹汤铭玉
（浙江树人大学生物与环境工程学院浙江杭州３０１）１０５
摘
要：为研究表达重组ＩＦＩＧ —（人胰岛素样生长因子一）－菌的优化发酵工艺条件，ＩＹ程．考察了３种
不同培养基以及诱导时机、导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响，５自控发酵罐进行分批补料培诱用Ｌ
养实验，定高密度发酵工艺条件。结果表明，２ＹＴ０％葡萄糖为发酵培养基，０８ｍｏＬＰＧ确以ｘ＋．５经．ｍｌＩＴ／
Ｌ２Ｙ＋．％葡萄糖、Ｂ、ｘＴ０５Ｍ９等培养基配方参
缩小反应器的体积。细胞高密度培养可通过补料
分批培养法实现，方法既可满足菌体生长与产该物积累所需营养，能使各种培养基成分低于抑又制浓度，尤其是可控制葡萄糖浓度从而降低代谢抑制物质乙酸的积累。大肠杆菌（．ｌ表达系Ｅｃｉｏ）统是基因工程菌产业化的理想系统，具有培养方便、发酵周期短、本低廉等优点，重组蛋白在成但大肠杆菌表达系统中能否获得高产受诸多因素的
诱导５，ｈ通过控制溶解氧以及ｐ反馈补料方式，酵液最终菌体密度达到ＯＤ１（Ｈ发２．菌体５．／）目７０１Ｌ，ｇ的蛋白表达量约占茵体总蛋白的３％。立了该工程菌优化的高密度发酵工艺，Ｉ — 的下游纯化和０建为ＧＦＩ工业化生产奠定了基础。关键词： — 工程菌高密度发酵ＩＧＦＩ

[1174]《生物药学》

西南大学网络与继续教育学院课程代码： 1174 学年学季：20192单项选择题1、基因工程菌的稳定性至少要维持在（）以上. 30. 25. 40. 202、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是（）.降低免疫源性.延长半衰期.降低相对分子量.增加组织通透性3、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源.葡萄糖.甘油.甘露醇.蔗糖4、以下可用于菌种纯化的方法有（）.诱变处理.富集培养.高温灭菌.平板划线5、第三代抗体是指：（）.利用基因工程技术制备的基因工程抗体.融合细胞产生的单克隆抗体.多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白. B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白6、获得目的基因最常用的方法是：.化学合成法.逆转录法. DNA探针技术. PCR 技术7、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细.人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定.人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用.大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活.大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化8、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：（）.表达产物为糖基化蛋白质.表达产物为天然产物.容易培养，产物提纯简单.表达产物存在的部位是在菌体内9、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的主要区别是（）.糖基化.疗效可靠.产量高.性质稳定10、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是：（）. BME. RMP1640. HT. HAT11、鼠源性单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是（）.单链抗体. Fab 片段抗体.单域抗体.最小识别单位12、目前分离的1000多种抗生素，约2/3产自（）.病毒.细菌.放线菌.真菌13、基因表达最常用的宿主菌是：（）.大肠杆菌.枯草芽孢杆菌.酵母.链霉菌14、第三代生物技术（）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围. F. 海洋生物技术.细胞工程技术.基因工程技术.蛋白质工程技术15、发酵生产中培养基的成分是( ).碳源硫源无机盐和水.碳源氮源和水.碳源氮源无机盐微量元素和水.碳源氮源碱土金属元素和水16、人类第一个基因工程药物是：（）.人胰岛素.乙型肝炎疫苗.重组链激酶.促红细胞生成素主观题17、细胞因子参考答案：由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽物质18、生物药物参考答案：利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学、生病的制品19、发酵工程制药参考答案：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的药品，或直接把微生物应20、胰岛素参考答案：是胰脏的内分泌组织。

基因工程菌的发酵

基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基生长速率限制性基质程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点禁止 DNA 片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因（DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高

高密度发酵

葡萄糖
1
减少酶1活性减少丙酮酸的合成
磷酸烯醇式丙酮酸
克隆酶3基因增加乙偶姻的合成 3
乙偶姻
2
丙酮酸
4
乙柠檬酸循环
减少酶7活性 7 减少乙酸的形成
乙酰磷酸
8
乙酸
9
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
对碳代谢流进行分流
10
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
提高供氧能力
在一般情况下，溶解氧是菌体生长的限制因子。
7
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
阻断乙酸产生的主要途径
8
改造受体菌的遗传性，减少或消除乙酸的生产
1. 磷酸转移酶 2. 丙酮酸激酶 3. 乙偶姻合成酶 4. 丙酮酸脱氢酶 5. 乳酸脱氢酶 6. 柠檬酸合成酶 7. 磷酸转乙酸基酶 8. 乙酸激酶
限制进入糖酵解途径的碳代谢流
细胞膜
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
葡萄糖磷酸葡萄糖
11
二、实现高密度发酵的方法
2. 构建出产乙酸能力低的工程菌
引入血红蛋白基因
遗传改造工程菌的输氧能力，不再使贫氧成为工程菌限制因子
12
二、实现高密度发酵的方法
3. 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
13
生物技术制药第二章基因工程制药
第九节高密度发酵
1
一、影响高密度发酵的因素
1. 培养基 2. 溶氧浓度 3. pH 4. 温度
2
一、影响高密度发酵的因素
5. 代谢副产物
1. 磷酸转移酶 2. 丙酮酸激酶 3. 乙偶姻合成酶 4. 丙酮酸脱氢酶 5. 乳酸脱氢酶 6. 柠檬酸合成酶 7. 磷酸转乙酸基酶 8. 乙酸激酶

高密度发酵.

通过发酵条件的改进可以减少乙酸的产生，但是难以做到精细的调控，通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。
①阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除或突变产生乙酸代谢突变菌株。
②对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有选择的向乙醇的方向进行。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的初始物料的特点 ①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养
基的来源及其质量。③生产工艺及条件。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求。
二、分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从
正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。
第九节高密度发酵
高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达 200gDCW/L。
高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而达到降低生产成本，提高生产效率。
四、固液分离
1、离心沉淀 2、膜过滤：微滤；超滤；反渗透 3、双水相萃取：两种水溶性高聚物或
可处理少量样品，产生热量大，敏感物质易失活。
2、化学破碎法
渗透冲击：先将细胞置于高渗透压介质，达成平衡后，突然稀释介质，在渗透压的冲击下，使细胞壁和膜膨涨破裂。
适用于细胞壁较脆弱的，经过酶处理的细胞壁。
增溶法：利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。
氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。
2 溶氧浓度

基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术

生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。

（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。

2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。

重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。

发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。

工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。

目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。

另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。

当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。

补料的流加方式直接影响着发酵的效果。

分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。

但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。

过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。

高密度培养

磷是dna的组成成分酵母膏蛋白胨等可以提供全面的营养碳源补加葡萄糖甘油甲醇等氮源自动补加氨水同时调节phph细水长流防止有毒代谢产物积累抑制细胞生长
基因工程菌高密度培养
High Cell-Density Culture
浙江工业大学杭州
课前思考：
1、为什么凉开水养不活鱼？
2、为什么菜市场卖鱼的地方需要一个鼓气设备？ 3、什么物质在水中的溶解度随着温度的升高而降低？ 4、进一步增加鱼的密度，而且要保证鱼不死，你能想出其它办法吗？
c、磷：磷是DNA的组成成分
酵母膏、蛋白胨等可以提供全面的营养
3、解决环境毒性问题部分微生物代谢产物对细胞有一定的毒性。比如乙酸（酵解产物） pH改变
4、防止质粒丢失
丢失质粒的细胞具有生长优势，但是它不含目的基因，所以不能合成产物。
解决方案
1、关于供氧：
a、通入空气、搅拌
b、提高搅拌速度
关于质粒丢失：
在培养基中添加抗生素，丢失质粒的细胞不能生长或死亡，即给予适当的选择压力。
氨苄青霉素易失活，培养中期补加氨苄青霉素，维持选择压力
诱导时机的选择也非常重要在生长前期，无诱导剂可以使细胞快速生长，加入诱导剂诱导目的基因表达会抑制细胞的增殖能力。所以，过早诱导会影响细胞密度。在细胞达到一定密度以后加入诱导剂，可以得到高密度发酵液。一般选在对数生长期的中后期诱导
高密度培养：
单位体积内细胞数量高于常规的培养模式。 E.coli最高密度理论值：400g/L （DCW Dry Cell Weight）国外达到：200g/L
国内小于50g/L
高密度培养的意义：
1、节约诱导剂的用量：摩尔浓度
相同，体积越小，诱导剂用量越少。

基因工程菌培养

-
培养温度
高温提高生长速度低温增加重组菌稳定性对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。
-
诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
-
选择合适拷贝数的菌株在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。
考虑将发酵过程分阶段控制两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
-
控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
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pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。

2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来

2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。

答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。

重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。

通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。

在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。

关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。

重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。

目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。

分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。

大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。

产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。

但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。

因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。

1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。

现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。

表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。

发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)

发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。

许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。

由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。

所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。

本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。

1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。

不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。

这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。

业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。

发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。

接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。

接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。

且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。

一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。

种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。

如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。

工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。

2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。

有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。

如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。

基因工程菌的发酵研究

《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.2基因工程菌的发酵研究李会成　李文辉　郭　军　刘利民(哈尔滨市医药工程技术研究开发中心　150020)摘要　本文对大肠杆菌表达的rhG M-CSF工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响,优化了影响发酵的各种条件,形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺,并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。

关键词　工程菌发酵　外源蛋白　高密度　高表达利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产之目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染,外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。

一、材料与方法111　材料重组工程菌系本所保存,宿主菌为E.co li DH5a。

Yeast Ex tract,Po lypep tone均为OX I OD 公司产品,其它所需试剂均为国产分析纯试剂。

112　方法11211　摇床条件下培养:30℃,120rpm培养到OD600达012-018时,水浴升温到42℃,继续培养3小时,取1m l离心收集菌体,做SD S2 PA GE分析。

11212　rh G M2CSF表达量测定用常规SD S-PA GE分析,用Phar m acia公司激光扫描仪扫描分析。

SD S2PA GE方法按文献(1)方法做。

11213　发酵采用美国NB S公司的40L发酵罐,按操作说明书操作。

11214　菌体测量采用称重法和浊度法。

11215　9501批发酵不添加任何营养物,9502批,高密度发酵都采用流加工艺,补加有机营养。

基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术

(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)

基因工程菌发酵及相关技术交流

高密度发酵概述

第七章 基因工程菌的发酵生产

植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵

基因工程菌发酵

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶

生化工程-基因工程菌培养

IGF—I工程菌的高密度发酵与工艺优化

[1174]《生物药学》

基因工程菌的发酵

高密度发酵

高密度发酵.

基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术

高密度培养

基因工程菌培养

2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来

发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)

基因工程菌的发酵研究

第七章基因工程菌的发酵生产