动物肝脏DNA提取和鉴定-实验技术

DNA标准液200ug/ml:DNA钠 盐用5mmol/L的NaOH配制。

95%冷乙醇、 NaCl固体

0.14mol／L NaCl－0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液(PH=6.8)

二苯胺：称取纯二苯胺1g溶于 100ml冰醋酸中，加入10ml过 氯酸，混匀。临用时加 1ml1.6%乙醛溶液，所配置试 剂应为无色。
以吸光度A595nm对DNA含量（ug）作图，
绘制标准曲线。
从标准曲线上查出样品的DNA含量。 计算100g猪肝中DNA的含量：
待测样品中DNA的质量×25(稀释倍数)
=
称取猪肝的质量
注意事项
匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。 固体NaCl应磨碎，加入应分批缓慢加入，边加边摇，
避免局部浓度过大或者未及溶解而沉入氯仿层。
核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在， 用DNP和RNP表示。
DNA-Pro（DNP）溶于高盐溶液（1mol/L）, 微溶于低盐溶液（0.14mol/L） 细胞核 RNA-Pro(RNP) 核仁及细胞质
溶于低盐溶液（0.14mol/L）
微溶于高盐溶液（1mol/L）
核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针 对DNA和RNA的颜色反应方法。
脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基γ-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在 595nm处有最大的吸收 。
DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
三、实验试剂
来自百度文库5% SDS

氯仿/异戊醇=20：1 （V/V）
变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋
白质及下层的氯仿吸入。
实验结束后将变性的蛋白质（肝糜）小心取出置于专
用的废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。
THANK YOU

防止DNA酶的降解，提取时可 加入适量EDTA（乙二胺四乙 酸）、柠檬酸，以降低DNA酶 的活性

SDS（十二烷基硫酸钠）等去 污剂使蛋白质变性，可以直接 从生物材料中提取DNA
DNA的定量测定
DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作为待测品。
混匀，60℃水浴保温45min，冷却后，595nm处，比色。
组织捣碎匀浆机
猪肝8g 16ml的0.14mol／L NaCl－
0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液
沉淀
40ml的0.14mol／L NaCl－
0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液
匀 浆 离心， 4000r/min ,10min 上清（弃掉） 沉淀 25ml缓冲液洗涤 离心， 4000r/min ,20min
21ml氯仿/异戊醇 4ml 5% SDS 振荡 30 min（保鲜膜封口） 加入3.6gNaCl 固体， 终浓度为1mol/L 离心，3500r/min ,20min 吸取上清（量取体积） 95%冷乙醇（缓慢加入）边 加边朝一个方向缓慢搅动 DNA粗制品
上清（弃掉）
沉淀
除去蛋白质的方法

氯仿一异成醇使蛋白 质变性，离心除去变 性蛋白质
动物肝脏DNA的制备 和鉴定
甘肃中医药大学
核酸的分类

DNA (脱氧核糖核酸) 主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿 体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用：
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。
2.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的酶
DNase:降解DNA
RNase：降解RNA
蛋白酶K：降解蛋白质
溶菌酶：破碎细胞

核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核 酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出 来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺 酸钠、三异丙基萘磺酸钠
核酸提取的主要步骤

破碎细胞：研磨、组织匀浆、 超声、冻融；异硫氰酸胍、 碱裂解；酶解（溶菌酶）
除去其它不需要
的核酸分子

除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、 脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、 蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍 等）、蛋白酶处理、高盐洗涤

沉淀核酸，去除盐类， 有机溶剂等杂质
注意事项


核酸的理化性质

在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在

微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来

基因组DNA的提取方法
浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解 度不同将二者分离。

离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴
化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取 DNA。
苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase 的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键 已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相 溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

避免过酸、 过碱及高温
蛋白变性剂反应
不宜过于剧烈

加入DNA酶抑制剂：柠 檬酸、氰化物、砷酸盐、 EDTA、SDS、苯酚等

加入RNA降解 酶除RNA
一、实验目的：
• 1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及 其原理。
• 2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。
二、实验原理