Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
2-folin-酚试剂法测定蛋白质含量
生物化学与分子生物学实验教学中心
绘制标准曲线-1
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标， 用铅笔绘制标准曲线。
吸光度A
0.6 0.4 .
.
.
0.2 . 40 80 120 160 蛋白质浓度C（μg/ml）
（要写图题）
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绘制标准曲线-2
根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲 线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线 不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实 验点均匀分布在曲线或直线两侧。
ห้องสมุดไป่ตู้
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何 注意？
请将答案附在实验报告上！
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值日生工作
实验完毕，组长登记实验室使用记录。 关闭仪器电源。
清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾。
回收试剂：将血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液 试剂收回放至准备室冰箱。 碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干 净，将试剂瓶放至准备室）。
注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时 ，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试 管，以此类推。
什么是双缩脲反应？
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2） ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发 生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物。
folin酚试剂法实验报告
folin酚试剂法实验报告一、实验目的Folin 酚试剂法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
本次实验的目的是通过使用 Folin 酚试剂法，掌握其操作流程，熟练运用相关仪器设备，准确测定给定样品中的蛋白质含量，并对实验结果进行分析和讨论。
二、实验原理Folin 酚试剂法的原理基于蛋白质中的肽键在碱性条件下与铜离子形成络合物，该络合物能将 Folin 酚试剂还原，产生蓝色物质。
蓝色物质的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，通过测定其在一定波长下的吸光度，可以计算出样品中蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、实验材料（1）标准蛋白质溶液：准确称取一定量的结晶牛血清白蛋白，用蒸馏水配制成浓度为 1mg/mL 的标准溶液。
（2）待测样品溶液：准备好需要测定蛋白质含量的样品溶液。
（3）Folin 酚试剂甲：由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成。
（4）Folin 酚试剂乙：由钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸和硫酸锂组成。
2、实验仪器（1）分光光度计（2）恒温水浴锅（3）容量瓶（100mL、50mL、10mL 等）（4）移液器（5）试管（6）刻度吸管四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干燥洁净的试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。
（2）按照下表向各试管中加入标准蛋白质溶液和蒸馏水：｜试管编号｜ 0 ｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（mL）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（mL）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜（3）向各试管中加入 Folin 酚试剂甲 5mL，摇匀，于室温下放置10 分钟。
（4）再向各试管中加入 Folin 酚试剂乙 05mL，立即摇匀，在 30℃水浴中保温 30 分钟。
（5）以 0 号试管为空白对照，在分光光度计上于 650nm 波长处测定各管溶液的吸光度值（A）。
（6）以蛋白质含量（mg）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。
folin酚法测定蛋白质含量
folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法，其历史可以追溯到1948年。
此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应，生成一种深蓝色的复合物，该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。
以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤：一、实验准备1.实验材料：o待测样品（蛋白质溶液）o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备：o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂：将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中，充分研磨后转移至烧杯中，加入80ml的蒸馏水，搅拌至溶解。
将溶液煮沸并保持1分钟，然后冷却至室温。
将混合物转移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。
4.取1ml待测蛋白质溶液（约0.01-1mg蛋白质）加入到试管中。
5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂，混匀。
6.将混合物在室温下保持30分钟，期间不时搅拌。
7.在760nm波长下，用分光光度计测定混合物的吸光度。
为了获得更准确的结果，可以以蒸馏水为空白对照调零。
8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。
可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。
根据待测样品的吸光度，可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。
9.根据需要，可以进一步计算蛋白质的含量（mg/mL或mg/g）。
三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感，如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当，可能会影响到最终的测定结果。
因此，操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。
2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品，这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应，导致结果偏差。
3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基，这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，导致吸光度偏高，最终结果可能偏高也可能偏低。
蛋白质含量测定方法folin—酚试剂法
蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。
由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。
步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。
2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。
3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。
4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。
6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。
注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。
2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。
3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。
4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。
在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。
* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。
* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。
总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
folin酚试剂法测定蛋白质含量
注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
– 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时 ，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 – 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试 管，以此类推。
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选择测定方法时应考虑
实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；
溶液中存在的干扰物质；
测定所花费的时间等。
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本法概述
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸 -磷 钼酸）起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加 碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
试剂
1.牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）
2.碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3.Folin-酚试剂
仪器与器材
1.V-1100分光光度计
2.恒温水浴箱 3.试管6支、试管架 4.加样枪、加样枪架
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操作步骤
取6支试管，做好标记，按下表顺序操作：
加入物（ml） 1 2 3 4 5 6
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V-1100分光光度计操作步骤
开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。按 将黑体放入光路中，合上盖，按
MODE 0%
键切换到T档 键校零
开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上 盖，按 键切换到A档 MODE
实验二福林酚试剂法测定测定蛋白质的含量
• 2. 有哪些因素可干扰 Folin－酚测定蛋白含量？
• 3.含有什么氨基酸的蛋白质能与 Folin-酚试剂 呈蓝色反应？ • 4.测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外， 还可以用什么方法
八、分析讨论
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100g
快速 5 ～ 10 分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 2 8 0 nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
五、 操作
• 1、标准曲线制作： 各吸取 0、0.2 0.4 0.6 0.8 1.0ml标准蛋白 液于带塞小试管，分别加入不同量的蒸馏水到 1ml ，各加5ml 试剂甲，混匀后室温下（25℃） 放10分钟，加入 0.5ml试剂乙，立即混匀，25℃ 左右反应30分钟，于500nm波长下测定消光值， 以OD500为纵坐标，含量为横坐标，绘出标准曲 线，（浓度低时可用OD750nm）
Folin－酚试剂 法 （ Lowry 法 ）
灵敏度高 ～5g
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5 ～ 15 分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
• 2、样品测定
取0.2、0.4、 0.6ml样品液加5ml 试剂甲，
混匀后室温下（25℃）放10分钟，加入 0.5ml
folin酚法测定蛋白质含量
Folin-酚法测定蛋白质含量是一种灵敏的方法，最早由Lowry确定蛋白质浓度测定的基本步骤。
这种方法的显色原理与双缩脲法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
此法使用的试剂有A液和B液。
A液由4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等体积混合而成。
B液由1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合而成。
每次使用前将A液与B液按50：1的比例混合即成。
这种试剂只能使用一天，过期失效。
在进行测定时，先将试剂乙倒入试剂甲中，摇匀后立即用其测定的样品，在一定条件下进行显色反应，之后在规定时间内记录光密度值，以测定蛋白质含量。
请注意，Folin-酚法在操作过程中需要注意一些细节，比如试剂的配制和保存、样品的处理、显色反应的条件等。
具体操作步骤和注
意事项建议咨询专业人士。
Folin-酚法测定蛋白质含量
实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的要求了解Folin–酚法测定蛋白质的原理，掌握Folin–酚法测定蛋白质含量的分析方法。
二、实验原理用化学法测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、双缩脲比色法、Folin–酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。
凯氏定氮法多用于贮存蛋白的测定；后者常用于可溶性蛋白的含量分析，它们具有操作简便，迅速，可适合一般实验要求的特点。
其中Folin–酚法较双缩脲法灵敏100倍，与考马斯亮蓝比色法灵敏度相似，但干扰物对检测方法的影响不相同，选用时应予考虑。
Folin–酚试剂由甲、乙两部分组成。
作用机理是：首先蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，生成铜—蛋白质复合物；然后该复合物还原磷钼酸—磷钨酸试剂，产生蓝色反应，其呈色强度与蛋白质含量成正比。
所测定蛋白质样品中若含有酚及柠檬酸均对实验有干扰。
浓度较低的尿素（约0.5%），三氯乙酸（约0.5%），乙醇（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响。
若样品酸度较高，需提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1–2倍。
三、试剂和仪器（一）试剂1、酪蛋白标准溶液：称取50mg酪蛋白（预先用凯氏定氮法测定蛋白质含量），加30mL 0.05mol/L NaOH ，于磁力搅拌器下溶解，补加0.05mol/L NaOH 至100 mL。
酪蛋白含量0.5 mg/ mL。
2、Folin-酚试剂试剂甲：（1）4% Na2CO3；（2）0.2 mol/L NaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钾钠溶液。
使用前，将（1）与（2）以等体积混合配置成Na2CO3–NaOH溶液；（3）与（4）以等体积混合，配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液；然后将这两种溶液以50:1的体积混合，即为Folin–酚试剂甲。
该试剂只能用一天，过期失效。
试剂乙：在1000 mL磨口回流装置内加入50g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），12.5g 钼酸钠（Na2M O O4·2H2O），350 mL 85%磷酸，50 mL浓盐酸，混匀。
【2017年整理】Folin-酚比色法测定蛋白质含量
实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量一. 目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。
在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。
该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。
注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。
三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管：20mL×8容量瓶：100mL×1移液管：1mL×4 5mL×1烧杯：250mL×1 50mL×1滤纸：φ11cm滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. Folin-酚试剂甲●溶液A：Na2CO310gNaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；酒石酸钾钠0.25g●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。
该混合液只能保持一天。
3. Folin-酚试剂乙●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。
实验五 Folin酚法测定蛋白质含量
下次实验：SDS-PAGE
然后，蛋白质Cu2+ 复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基 还原乙试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物 （钼蓝和钨蓝混合物）。
该呈色反应在 30min内即接近极限，并至少可稳定几小 时。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质含量呈线性关 系，所以，可用比色的方法确定蛋白质的含量。
Fo1in－酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。在640nm下 测定范围是25－250微克。
Fo1in—酚法是双缩脲法的发展。 Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。
– 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组 成。（碱性）
– 乙试剂由磷钼酸和磷钨酸组成。（在碱性中极不稳定）
反应过程分为两步：
首先，在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试 剂中的 Cu2+作用生成蛋白质Cu2+ 复合物；
该呈色反应在30min内即接近极限并至少可稳定几小在一定浓度范围内蓝色的深浅与蛋白质含量呈线性关系所以可用比色olin-酚试剂法（Lowry法）
一、目的和要求
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测
（一）试剂 1.标准BSA溶液：250μg／mL。 2.Fo1in—酚试剂甲 3.Fo1in—酚试剂乙 4.蛋清：稀释后用。
（二）器材 1.试管及试管架 2.吸量管(5、1、0.5mL) 3.722型分光光度计 4.电热恒温水浴
Fo1in—酚试剂甲的配制
由下述四种溶液配制： (1)4％碳酸钠溶液；和 (2)0.2mol/L氢氧化钠溶液； (3)1％硫酸铜(CuS04·5 H20)溶液； (4)2％酒石酸钾钠溶液。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 本实验以蛋清为材料，测定蛋清的蛋白质含量。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量实验目的掌握Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。
提高在严格时间限定下的实验操作能力。
二、实验原理蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸- 磷钼酸）起蓝色反应，此法由folin 在1921 年开创。
1951年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲（H2NOC－NH－CONH2能）与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物。
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
第二步：Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐- 磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。
蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。
三、实验材料（一）样品健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L ）（二）试剂牛血清白蛋白标准液（200μg/ml ），碱性硫酸铜溶液，Folin- 酚试剂（三）仪器与器材V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，试管6 支，试管架，加样枪，加样枪架四、实验步骤（一）操作步骤见表1-1表1-1 folin- 酚试剂法定量蛋白质实验步骤重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。
二）注意事项1.操作控制：folin- 酚试剂加到碱性铜- 蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸- 磷钨酸被破坏之前2.时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。
生化大实验实验五 Folin–酚试剂法测定蛋白质含量
2.样品测定：取1.0mL样品溶液（约含20 ～250µg 2.样品测定：取1.0mL样品溶液（约含20 多肽或蛋白质）于试管中，加入5mL试剂甲，混 多肽或蛋白质）于试管中，加入5mL试剂甲，混 匀后同标准溶液测定。（本次实验样品取0.1加 匀后同标准溶液测定。（本次实验样品取0.1加 0.9ml蒸馏水再测定） 0.9ml蒸馏水再测定） 3.结果与计算：根据测定管吸光度查标准曲线，由 3.结果与计算：根据测定管吸光度查标准曲线，由 标准曲线计算样品蛋白含量。
这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。 对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而 对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而 且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及 柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、 柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、 胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1 胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1％）、三氯 乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0 乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0．5 ％）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲 线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显 色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸 钠 — 氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。 氢氧化钠溶液的浓度1 进行测定时，加 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏 试剂仅在酸性 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 10 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 - 蛋白质溶液 中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏之 前，还原反应即能发生。
Folin酚法测定血清蛋白质含量
实验8 Folin—酚法测定血清蛋白质含量一、目的1、学习分光光度计的原理和使用方法。
2、学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。
二、原理蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩脲反应，Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。
Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin氏剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。
Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。
所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。
含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后色浅。
则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。
三、材料、试剂与器具（一）材料血清：使用前稀释100%（二）试剂1、标准酪蛋白溶液：称取125毫克酪蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到250 毫升，则配成500微克/毫升的标准酪蛋白溶液。
2、Folin—酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。
（1）4%碳酸钠溶液（2）0.2N氢氧化钠溶液（3）1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液（4）2%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1）和（2）等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液。
将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。
然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为Folin—酚试剂甲。
该试剂只能用一天，过期失效。
3．Folin—酚试剂乙：在2升的磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100克，钼酸钠（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸馏水700毫升，85%磷酸50毫升和浓盐酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小时，再加入硫酸锂（L i2SO4）150克，蒸馏水50毫升及数滴液体溴。
04Folin酚法测定蛋白质含量
04Folin酚法测定蛋白质含量Folin酚法是一种测定蛋白质含量的方法，也被称为Lowry法。
该方法利用一种化学试剂（Folin酚试剂）与蛋白质结合形成复合物，进而产生颜色，利用光度计测量颜色强度，从而间接测定蛋白质的含量。
本文将对Folin酚法的操作流程、原理、注意事项等方面进行介绍。
Folin酚法的操作流程如下：1. 样品制备：将要测定蛋白质含量的样品加入到离心管中，并加入约5倍体积的碳酸氢钠（NaHCO3）溶液，使样品呈弱碱性，再加入NaCl，使浓度为50-100mM。
2. 加入Folin酚试剂：按照试剂的工业需求用水稀释Folin试剂，取样品中的0.1-2.0mL加入到TestTube中，再加入等量的加热后冷却的NaOH(1M) ，然后加入Folin试剂，快速摇匀并放置15分钟至30分钟。
会出现从棕色到蓝色等级变化（酚蓝色）。
3. 加入Na2CO3：在试管中加入5倍浓度的Na2CO3溶液，缓慢滴加并充分混合，使液体呈现深蓝色（如图），在紫外线灯下，黄色到红色颜色具有固定的比色距离和线性使用范围，通常是500-700nm。
4. 测量吸光度：样品和对照体使用小细长试管，在波长下读取吸光度数据。
对每一标准曲线，使用标准品生产的校正硝酸钠或牛清蛋白制备出蛋白标准品。
在制定标准曲线时，使用的标准品范围是0.1-1.0mg / ml因为该范围内蛋白质浓度的吸光度与蛋白质浓度之间的线性关系较好。
对一定量的蛋白质或多肽样品添加到含有Folin试剂和NaOH的试剂中，在碱性条件下，Folin试剂会被蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等还原物质还原，形成可被吸收的蓝色化合物。
随着Na2CO3添加，蛋白质中的肽键还原Cu2+为Cu+，与Folin试剂中还原少量的Cu2+形成可吸收的化合物，产生蓝色颜色。
其实质是铜离子作为氧化剂，被蛋白质中的酚类、组氨酸等还原，然后由还原形成的电子捕获剂向Folin试剂中的fosfomolybdate 复合物媒介过渡，形成可吸收的复合物，具体反应方程式如下：a. Cu(II)+RNHCO-R’-R’’ → Cu(I)+R-NH2 + R’CO-R’’（还原）b. Cu(I)+3MeOH+NaF-Fe(III)(CN)5(NO) → Fe(II)(CN)5NO+NaF+Cu(II)+3MeOHc. Folin-Ciocalteu试剂+Copper-chelating(还原Cu2+->Cu1)+MeOH+(±)Na2CO3 → (MeOH的)紫色染料吸收（‘Folin-Ciocalteu’光度分光光度），与Na2CO3浓度成比例注意事项：1.样品的体积或质量应该控制在不同范围内，不宜过多或过少。
生化大实验实验五Folin–酚试剂法测定蛋白质含量
进行测定时，加 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏 试剂仅在酸性 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 10 的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 - 蛋白质溶液 中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏之 前，还原反应即能发生。
【操作步骤】
各管混匀后加入5mL试剂甲，混匀，于37℃放置10分 钟。再加入0.5mL试剂乙（Folin氏试剂），立即振摇均匀， 在37℃保温30分钟，然后于500nm或650nm比色测定。以 吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。 对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而 且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及 柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、 胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1％）、三氯 乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0．5 ％）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲 线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显 色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸 钠 — 氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
2.样品测定：取1.0mL样品溶液（约含20 ～250μg 多肽或蛋白质）于试管中，加入5mL试剂甲，混 匀后同标准溶液测定。（本次实验样品取0.1加 0.9ml蒸馏水再测定）
3.结果与计算：根据测定管吸光度查标准曲线，由
标准曲线计算样品蛋白含量。
【试剂】
1.标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，配制 成250μg/mL的溶液。 2. Folin - 酚试剂的配制（均用分析纯试剂）： 试剂甲：由下述四种溶液配制，（1）4％碳 酸钠（Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠 溶液；（3）1％硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液； （4）2％酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸 钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配 成碳酸钠 — 氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体 积混合配成硫酸铜 — 酒石酸钾钠溶液。然后将这 两种溶液按50： 1的比例混合， 即为Folin — 酚 试剂甲。该试剂只能用一天，过owry法）测定蛋白质含量
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。
二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。
Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2．仪器（1）722 型（或721 型）分光光度计（2）4 000r/min 的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3．试剂（纯度均为分析纯）（1）0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500 mL。
（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。
每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。
（3）试剂乙：在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。
回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。
然后稀释至 1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当于1mol/L。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
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.
.
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实验步骤示意
蛋白 标 准液
碱性硫 酸铜溶液
混合均匀 静置 10min
加酚 试剂
2s 内混 合均匀
40℃ 水浴 10min
冷一定浓度梯度溶液: 取 6 支试管分别编号 1 至 6，按下表加样。（1 作空 白对照，2-5 作标准，6 为待测样品）
1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸 铜溶液 2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。如 此类推混匀并将其静置在室温下。
根据吸光度数据绘制图表：
试管
1
牛血清蛋白标准液浓 0
度（µg/ml）
A500 平均值
0
2
3
4
5
6
40
80
120
160
-
0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146
参考资料
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将测得样品管吸光度 0.1460 代入标准曲线公式 y=0.0013x+0.0125 中，得出样品 浓度为 102.7µg/ml。 即： C（未稀释蛋白含量） = C（稀释后蛋白质含量）×2×300
2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。故通 过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的 标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。
三、材料和方法
样品：健康人血清（300 倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L 试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin酚试剂 仪器与器材： V-1100 分光光度计； 恒温水浴箱；试管 6 支、试管架； 加样枪、 加样枪架； 坐标纸
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四、结果与讨论：
结果： A，实验过程现象： 1，在向试管中加入 2ml 碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无明显现象； 2，在向试管中加入 0.20mL Folin-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液由浅绿立 即先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。
B，吸光度数据：
500nm 波长吸收度值记录
测定次数
2，在使用分光光度计测吸光度时，因未能及时将溶液转移至比色皿而导致分别 测定 2-6 试管时各组测定时间的时间间隔不一致，以及在读数时未等读数稳定就 读数均可导致测量误差。
思考题
A.试述 Folin-酚试剂法的优点？ 答：该方法联用 Folin-酚试剂法和双缩脲试剂法测定蛋白质含量可使显色反应 更为明显，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。故通 过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的 标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。
三、材料和方法
样品：健康人血清（300 倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L
试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin酚试剂
B.应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？ 答：1，应用本方法的干扰作用：能干扰双缩脲反应的基团以及在性质上是氨基 酸或肽的缓冲剂（如蔗糖，硫酸铵，巯基化合物等）的干扰以及反应的时间差异 的干扰。
2，造成上述干扰作用的原因为：此法是在 Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂 而成，故所以凡干扰双缩脲反应的因素亦可干扰本方法。同时此反应的显色程度 随反应时间的延长而不断加深，故反应时间的不一致亦为应用本方法的一个干扰 作用。 3，因此需注意事项有：在实验过程中防止因操作不规范而引入干扰杂质以及严 格的控制反应时间。
1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸 铜溶液 2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。如 此类推混匀并将其静置在室温下。
2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样 10 分钟后，于第 1 支试管立即加入 0.20mL Folin-酚试剂，并于 2s 内摇匀。1 分钟后第 2 支试管加 入 0.20mL Folin-酚试剂，2 分钟后加第 3 支试管，以此类推。
各管吸光度值 A500
2
3
4
5
1
0.063
0.119
0.173
0.222
2
0.059
0.119
0.171
0.219
3
0.064
0.118
0.175
0.212
—
各管平均值A500
0.0620 0.1187 0.1730 0.2177
（对照组的实验数据均为 0）
6 0.148 0.150 0.140
0.146
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
一、实验目的
1，掌握 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术；
2，掌握制作标准曲线的要领；
3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
二、实验原理
1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与 Cu2+螯合形成蛋白质Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残 基可以还原 Folin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝 的混合物），即发生 Folin-酚显色反应。同时，在碱性条件下 Folin-酚试剂极 不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。
= 102.7µg/ml×600 = 61.62µg/ml = 61.62g/L 正常人血清蛋白浓度参考范围为：60~80g/L 以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实 验成功。
讨论： A：本次实验中操作严格按照实验要求进行，故所测样品结果 61.62g/L 落在正常 范围内。与同实验室另一小组所测结果（61.80g/L）相比差距很小，故可认为本 次实验成功。 B：实验误差分析如下： 1，在使用加样枪移液过程中可因试液未完全放入试管而有少许残留于移液枪头 导致操作误差。
试剂（ml）
空白管
1
2
牛血清蛋白标准液
-
0.20
样品液（稀释 300 倍） -
-
蒸馏水
1.0
0.80
碱性硫酸铜
2.0
2.0
Folin-酚试剂
0.20
0.20
蛋白质浓度（µHale Waihona Puke /ml） 040标准管
3
4
0.40
0.60
-
-
0.60
0.40
2.0
2.0
0.20
0.20
80
120
样品管
5
6
0.80
-
-
0.50
0.20
0.50
2.0
2.0
0.20
0.20
160
未知
B，加样完毕后将各试管每隔 1min 按 1-6 顺序放一只试管入水浴箱，分别 40℃ 水浴 10min 后取出冷却至室温。
C，以 500nm 波长比色，以 1 号管作空白对照，按 2-6 顺序每隔一分钟测定一支 试管内溶液吸光度并重复测三次，记下读数，求出平均值，记录数据并计算结果。
仪器与器材： V-1100 分光光度计； 恒温水浴箱；试管 6 支、试管架； 加样枪、 加样枪架； 坐标纸
实验步骤示意
蛋白 标 准液
碱性硫 酸铜溶液
混合均匀 静置 10min
加酚 试剂
2s 内混 合均匀
40℃ 水浴 10min
冷却 至室温
比色
详细步骤
A，配置一定浓度梯度溶液: 取 6 支试管分别编号 1 至 6，按下表加样。（1 作空 白对照，2-5 作标准，6 为待测样品）
根据吸光度数据绘制图表：
试管
1
牛血清蛋白标准液浓 0
度（µg/ml）
A500 平均值
0
2
3
4
5
6
40
80
120
160
-
0.0620 0.1187 0.1730 0.2177 0.146
将测得样品管吸光度 0.1460 代入标准曲线公式 y=0.0013x+0.0125 中，得出样品 浓度为 102.7µg/ml。 即： C（未稀释蛋白含量） = C（稀释后蛋白质含量）×2×300