等电聚焦电泳和race原理
等电聚焦技术的基本原理
等电聚焦技术的基本原理等电聚焦技术是一种用于分离和纯化蛋白质或其他生物分子的技术。
本文将详细介绍等电聚焦技术的基本原理，主要包含以下几个方面：等电点、pH梯度、电泳、温度和缓冲液。
1.等电点等电点是指蛋白质等电点，即在溶液中同时存在正负电荷，且正负电荷量相等时的pH值。
蛋白质分子在等电点时呈电中性，最容易分离。
这是因为蛋白质分子在等电点时，正负电荷相互抵消，蛋白质分子不再带电，因此不容易再与其他分子相互作用，从而更容易被分离。
2.pH梯度在等电聚焦技术中，pH梯度是指溶液中不同部位的pH值不同，通常是在一个范围内变化。
通过控制pH梯度的变化，可以使得蛋白质分子在电场中的迁移率不同，进而使得不同的蛋白质分子得以分离。
pH梯度的建立可以通过使用缓冲液和调节溶液的酸碱度来实现。
3.电泳电泳是指带电粒子在电场中的移动现象。
在等电聚焦技术中，电泳主要是用于分离不同的蛋白质分子。
在电场作用下，带电的蛋白质分子会向相反电荷的电极移动，移动速度与蛋白质分子的电荷量、分子量和溶液的pH值等因素有关。
通过控制电场强度和电泳时间，可以进一步优化蛋白质分子的分离效果。
4.温度温度会影响蛋白质分子的状态和形状，进而影响其分离效果。
在等电聚焦技术中，温度主要通过影响水的体积来实现对蛋白质分离效果的影响。
温度升高会导致溶液的粘度降低，从而使得蛋白质分子的移动速度加快，有利于提高分离效率。
但是，过高的温度会导致蛋白质分子变性，影响其结构和功能，因此需要控制适宜的温度范围。
5.缓冲液缓冲液是指能够抵抗外来酸碱物质并保持其pH值稳定的液体。
在等电聚焦技术中，缓冲液的作用是保护蛋白质分子，使得其能够在电场中保持稳定的形态和结构。
常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。
缓冲液的选择应该根据具体实验条件和分离的蛋白质分子特性进行优化。
总之，等电聚焦技术是一种基于电荷和pH值分离蛋白质分子的有效方法。
通过掌握等电点、pH梯度、电泳、温度和缓冲液等基本原理，可以实现对蛋白质分子的高效分离和纯化。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
等电聚焦电泳和race原理
等电聚焦电泳（IEF)在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。
宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA 再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA—induced silencing complex，RISC)。
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。
被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解.RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。
等电聚焦电泳【共54张PPT】
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3
pIn
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复 性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分 离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率
降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2, 制模具：洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）6—8 ％尿素1ml Ampholine （pH3.5-10）60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦原理
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 分子的两性电解质的混合物所组成的 ， 设其中某一成分为A 它的pI=pH’ 设其中某一成分为 A， 它的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’ 它带负电荷， 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。 极移动。(图b)
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 分析分离制备蛋白质、 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 csf中寡克隆区带的检测 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 测定pI可鉴定蛋白质 可鉴定蛋白质、 3.双相电泳中，IEFE作为第一相 双相电泳中，IEFE作为第一相
3.其它检测方法 3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 电聚焦有高的分辨力， 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀， 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 预先除去。 蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。 占据了分离的有效部位。
pH
pH=pH’ A+ +
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解 质也会各自迁移到它们的等电点处， 质也会各自迁移到它们的等电点处 ， 由于 它们的数量足够多， 它们的数量足够多 ， 各自的等电点相差很 从而形成一个pH梯度 梯度。 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
等电聚焦电泳的原理及应用
等电聚焦电泳的原理及应用等电聚焦电泳，这个听起来复杂的名词，其实就像是一场精妙的舞会。
想象一下，各种各样的蛋白质、核酸，像小伙伴一样，聚集在一个舞台上，它们各自有自己的特长，有的擅长旋转，有的则能高高跳起，真的是热闹非凡。
好啦，今天就来聊聊这个舞会的规则和乐趣。
等电聚焦电泳，简单说就是利用电场把分子按照它们的等电点来分开。
每种分子在特定的pH值下会带上正负电荷，就像小朋友们在玩捉迷藏。
想象一下，有些小朋友喜欢在阳光下，而有些则喜欢在阴凉的地方玩耍。
这个等电点，就是分子在电泳中的“家”，它们会不遗余力地朝着自己的家奔去。
当电场施加时，分子们就像是在追逐游戏中疯狂奔跑，结果就是它们各自找到了最适合自己的地方，嘿，这可是个精彩的过程哦！说到应用，这个等电聚焦电泳就像一把万用钥匙，能够打开许多实验室的大门。
比如在蛋白质的分离上，它简直是个天才！许多科学家在做生物研究时，常常需要分离出特定的蛋白质。
这就好比你要从一堆水果中挑出苹果，当然得先知道苹果的特征。
而等电聚焦电泳正是通过调节pH值，让每种蛋白质在适合自己的地方聚集，就像是让苹果聚在一起，其他水果都乖乖地站在一旁。
你知道吗？这个方法不仅仅局限于研究蛋白质哦！在医学上，等电聚焦电泳也能派上大用场。
比如说，某些疾病的诊断，医生可以通过分析血液中的特定蛋白质来判断病情。
这就像是在给身体做一次“深度体检”，从中发现潜在的健康问题，简直是一种“未雨绸缪”的智慧。
说到这里，可能有人会问，这个过程会不会很复杂？其实不然，操作起来也算不上是太难。
只需要一些专业的仪器和实验室的环境，像个小化学家一样，轻松搞定。
不过，别忘了，实验中的每一步都得谨慎，哪怕是微小的差错，都可能导致结果大相径庭，就像你在做饭时不小心加错了盐，最后可能让整道菜变得难以下咽。
不过，最让人惊讶的是，这个技术的历史也蛮有意思的。
早在上世纪，科学家们就开始尝试用电泳分离分子，经过不断的摸索，终于找到了这条等电聚焦的路子。
等电聚焦电泳原理
等电聚焦电泳原理
等电聚焦电泳是一种常用的电泳技术，适用于分离与测量带有相近分子大小的生物分子。
其原理是利用电流和电场使带电生物分子在凝胶中移动，从而实现这些分子的分离。
等电聚焦电泳的基本原理是根据带电生物分子在凝胶中的异电点而进行分离。
异电点是指生物分子在特定pH值下，净电荷
为零的点。
在等电聚焦电泳中，一个pH 梯度被建立在凝胶中。
电泳开始时，电场中的带电分子会在其异电点处停止移动，因为此时分子的净电荷为零。
随着pH梯度的建立，凝胶中电场
的强度也会增加，这将使带电生物分子在偏离异电点的方向上移动。
通过调整电场的强度和时间，可以实现对特定分子数量、大小进行有效的分离。
等电聚焦电泳的优势在于，它能够对分子进行高分辨率的分离和定量。
通过调整pH梯度和电场强度，可以精确控制分子在
凝胶中的移动速度，从而实现对分子的准确分离。
此外，等电聚焦电泳还可以与其他电泳技术结合使用，如凝胶电泳和双向电泳，以进一步提高分离效果。
总的来说，等电聚焦电泳利用了分子在异电点附近的特性，通过建立pH梯度和调整电场强度，实现了对带电生物分子的有
效分离。
它是一种强大的生物分析工具，广泛应用于分离和测量复杂的生物分子混合物。
第七章、等电聚焦电泳技术
二、载体两性电解质
• 稳定的 梯度是等电聚焦技术的关键； 稳定的pH梯度是等电聚焦技术的关键 梯度是等电聚焦技术的关键； • 特殊的两性电解质可以实现pH梯度。 特殊的两性电解质可以实现 梯度。 梯度 两性电解质：同时带有正、 两性电解质：同时带有正、负电基团的化合 物。
1. 载体两性电解质必需具备的条件
第六章、 第六章、等电聚焦电泳技术
等电聚焦（ 等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF or EF)： ： 等电点聚焦就是在 电场中形成一个由阳极 到阴极逐步增加的pH梯 到阴极逐步增加的 梯 度，不同的蛋白质移动 并聚焦于与其等电点相 当的pH位置上 位置上， 当的 位置上，从而达 到蛋白质的分离目的。 到蛋白质的分离目的。
–聚丙烯酰胺凝胶使pH向阴极漂移 聚丙烯酰胺凝胶使pH向阴极漂移 聚丙烯酰胺凝胶使pH –琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约2个pH单位 琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约2 pH单位 琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约
四、pH梯度的选择 pH梯度的选择
• 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体， 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体， pH3 的载体 经初步测定后改用较窄的以提高分辨率; 经初步测定后改用较窄的以提高分辨率; • 在使用pH7以上或以下范围时，因缺少中性 在使用pH7以上或以下范围时， pH7以上或以下范围时 载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7 载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7 部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低， 部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低， 必须避免此现象。凡使用离开中性的pH pH范围 必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围 的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6 0.1载体量的pH6的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或 pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时，可 pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时， 的载体 pH低于 加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸， 加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙 pH离于10时 可补加胺使pH增加到11 离于10 pH增加到11。 酸，pH离于10时，可补加胺使pH增加到11。
简述等电聚焦电泳法的原理、特点
简述等电聚焦电泳法的原理、特点原理:不同的蛋白质等电点不同，如果分子处于pH和等电点一致的溶液中，则泳动就停止进行。
如果溶液内的pH是位置的函数，或者说有一个pH的位置梯度，那么在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液中进行分离，每一种被分离的两性物质都移向与它的等电点相一致的pH位置，在那里不再移动。
由于在这点净电荷为零，因而又称等电聚焦。
特点：1、使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定的、连续的、线性的pH梯度。
2、由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰的、鲜明的区带界面。
3、电泳速度快。
4、分辨率高。
5、加入样品的位置可任意选择。
6、可用于测定蛋白质类物质的等电点。
7、适用于中、大分子量生物组分的分离分析。
等电聚焦电泳
HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的 主要成分，足月的初生婴儿血中大约有 70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出生后 不久，HbF的浓度迅速减少，同时HbA相 应增多，绝大多数正常人于出生后6个月 至2年后，HbF便降至成人的正常浓度， 以后HbF一直存在。
[器材]
电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头
pH梯度形成的过程
㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是 溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电 荷为零。
㈡引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷 其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净 电荷被减少到零才停止。
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好 的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度， 不干扰样品的测定。
2.载体两性电解质的合成
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝 负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
等电聚焦电泳
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
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等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
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2
二、IEFE的特点
（一）优点
1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
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3
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
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电解槽中，通电后，正负两极都会发生电
极反应：
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起pH值的升高，在正极pH 下降，另外在电极槽的正极端放的是酸 性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了 在电极附近pH的急剧变化。（图a）
②化学性质稳定；
③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好 的缓冲能力；
④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多；
⑥可溶性好；
⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度， 不干扰样品的测定。
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2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
电泳技术的基本原理和分类
电泳技术的基本原理和分类电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的基本原理和分类在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。
F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。
除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。
前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。
而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。
本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
影响电泳迁移率的因素⒈电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。
如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/2 0cm＝10V/cm。
当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。
电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。
电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
等电聚焦电泳名词解释
等电聚焦电泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）是一种电泳方法，即利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。
制备型等电聚焦电泳
实验步骤
4、在电极槽中加入电解液。
实验步骤
5、聚焦
①首先将制冷装置上的旋钮旋开。 ②将聚焦装置放入仪器底盘，聚焦槽上样口端和电极通气口端 向上。核实阳极端在左，阴极端在右。 ③用注射器向电极中加入电解液 ④加盖制冷装置盖子，并旋紧螺杆。 ⑤加盖仪器盖子 ⑥连接micro rotofor 分离器底盘后电源线和电源插座 ⑦连接micro rotofor 分离器到真空装置。 ⑧将振荡装置 ⑨根据实验需要将制冷开关设置到10或20 ℃ ⑩通过观察电压的变化过程，可以指示聚焦是否完成。
其它辅助设备及附件
辅助设备：电源
真空泵、真空阀、真空管
电解液用于平衡离子交换膜：0.1MH3PO4、 0.1MNaOH
20µl，100µl，1000µl 移液器，移液器头，50ml烧杯
附件：密封带
在运行过程中，密封带用于密封载样和收集端口。
密封膜 用于分离后承载样品组份的收集盘 3ml注射器 使用3ml注射器将样品加入到聚焦槽中 10ml注射器 使用10ml注射器将样品加入到电极槽中 镊子、清洁刷
器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。
②用载样注射器吸取样品溶液，从位于聚焦槽中央的载样口上样，至样品 溶液全部均匀渗漏到各个腔体内；或者采用在不同载样口上样，至样品 溶液在聚焦槽各个腔体分布均匀。（注意:在上样过程中注意不要产生气 泡，否则样品溶液在各个腔体内分布不均匀。如果出现气泡，可以将样 品吸出，从另外的载样口上样，注意同样不能产生气泡。 ③加载样品后，核实每一个聚焦体腔内是否充满样品溶液，并保证无气泡 。如果存在气泡，将影响后续的分离，因此请按上步措施进行处理。 ④擦干聚焦槽外部，用密封带将上样口密封。不要使用过长或过宽的密封 带，否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。
第五章 等电聚焦
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
Native PAGE和IEF原理的区别 PAGE和IEF原理的区别
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
蛋白质分子在偏离其等电点的pH 蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下 pH条件下 带有电荷，因此可以在电场中移动； 带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白 质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零， 质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零， 在电场中不再移动，就会产生聚焦现象， 在电场中不再移动，就会产生聚焦现象，形 成蛋白质区带， 成蛋白质区带，由此可将不同等电点的蛋白 质分开。 质分开。
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PH梯度的形成过程 3.4 PH梯度的形成过程
pH梯度形成的时间, pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和 梯度形成的时间 凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃, 凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间 12cm的玻璃 的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm， 的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用 10cm 1mm Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度 Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度 为载体两性电解质 pH 基本形成， 小时后无多大变化, 基本形成，2小时后无多大变化,如图
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等电聚焦电泳
循环流动等电聚焦示意图
第十四页，本课件共有21页
2. 分段固定化pH梯度装置
本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其 处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移 动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零， 泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦 在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率 极高。
第三页，本课件共有21页
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低 到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度，则处 于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所 处位点的oH值的差别带上正电或负电。
氧根离子的能力，使环境的pH等于载体两性电解质的pI，一直
向阳极顺延。
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第十二页，本课件共有21页
pH梯度支持介质
常用的pH梯度支持介质是凝胶，主 要有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡 聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶最为 常用。
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等电聚焦电泳装置
1. 循环等电聚焦
A、B是固定化两性电解质段，C段为充满载体液段，用一泵 把液体循环。最后杂质都收集到正、负极上，只余下等电点的蛋 白质在循环。利用这个设备可以处理大量液体和分离大量的蛋白 质，而且收率很高，存在的缺点是固定化两性电解质能够水解， 使pH场破坏。
分段固定化pH梯度装置示意图
第十五页，本课件共有21页
常用电泳仪
物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下， 自然形成pH梯度。
等电聚焦电泳
等电聚焦的基本原理
这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基 本原理。可见在该方法中，等电点是蛋 白质组分的特性量度，将等电点不同的 蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质 中，在电场内经过一定时间后，各组分 将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置 上，形成分离的蛋白质区带。
相等时,此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点(pI).
蛋白质是由氨基酸组成的,除了有末端-NH3+和末端COO-外,参与其组成的氨基酸残基侧链上还有酸、碱
性基团,因此蛋白质是两性物质,也有等电点.
等电聚焦的基本原理
不同的蛋白质或其他两性电解质具有不同 的等电点。如果某种蛋白质处于大于其等电点 的pH环境中，则带负电，在电场中必向正极泳 动；反之，当某种蛋白质处于小于其等电点的 pH环境中，则带正电，在电场中向负极泳动。
不同品牌的载体两性电解质性质上有细 微的差别，使用不同来源的载体两性电解 质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若 要获得最好的重复性一般不要更换载体两 性电解质的品牌。
电泳仪-AE6541
电泳仪-伯乐bio-rad
电泳仪--实验室
电泳槽--DYCP32型
等电聚焦电泳分离蛋白质
一、仪器与试剂
1．仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽 2．试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、
载体两性电解质
两性电解质，是脂肪族多胺和多羧类 的同系物，他们具有相近但不同的pKa 和pI值。在外电场作用下，自然形成pH 梯度，是一种特殊的缓冲液。
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等电聚焦电泳（IEF）
在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。
宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，
其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。
被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。
需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。
所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。
SMARTTM 3'-RACE原理
利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。
（见下图）
SMARTTM 5'-RACE原理
先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5' 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。
最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。