核酸探针标记
Fish探针标记方法大全
探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。
该技术可以制备序列特异的探针。
当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。
但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。
此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。
这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。
由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。
DNA片段的大小不影响标记的结果。
标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。
标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。
随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。
随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。
3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。
这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。
4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。
这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。
利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。
同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。
图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。
但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。
双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。
2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。
3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。
当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。
图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。
2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。
3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。
按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。
3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。
其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
核酸探针的名词解释
核酸探针的名词解释
嘿，咱今天就来聊聊核酸探针这玩意儿！你知道吗，核酸探针就像
是一个超级侦探，专门去寻找特定的核酸序列。
比如说吧，就好像你
在一个超级大的图书馆里找一本特定的书，核酸探针就是那个能精准
找到那本书的小能手！
它是一小段经过标记的核酸分子，这个标记就像是给它装上了一个
闪闪发光的信号灯。
然后呢，它就可以和目标核酸序列特异性地结合。
这就好比是一把钥匙开一把锁，可准了呢！
咱举个例子啊，想象一下，细胞里面的核酸就像是一群人，而核酸
探针就是那个能准确找到特定那个人的高手。
它能一下子就抓住目标，然后通过那个标记，让我们知道它找到了。
核酸探针的作用可大了去了！它可以用来检测病毒、细菌，还能在
基因诊断中发挥重要作用。
比如说，当我们怀疑身体里有某种病毒的
时候，核酸探针就能快速地找到它，告诉我们是不是真的有。
这多厉
害啊！
在科学研究中，核酸探针也是不可或缺的。
研究人员用它来探索基
因的功能，就像探险家在未知的领域寻找宝藏一样。
你说，核酸探针是不是超级神奇？它就像是一个默默无闻却又超级
厉害的小英雄，在我们看不见的地方发挥着巨大的作用。
总之，核酸探针就是那个能在核酸世界里精准定位、发挥关键作用的神奇存在！它是现代生物学和医学的重要工具，为我们解开生命的奥秘提供了有力的支持。
没有它，很多事情我们可都没法做呢！。
核酸探针描述课件
斑点印迹法是一种简单快速的核酸检测方法，其基本原理是将核酸样品直接点到 膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，检测目核酸序列。该方法具有操作简 便、快速、高通量等优点，广泛应用于基因诊断、基因表达分析等领域。
微孔板印迹法
总结词
一种将核酸结合到微孔板上的方法，用 于高通量检测多个样本中的特定核酸序 列。
等领域的研究提供了有力支持。
THANKS
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核酸探针的应用领域
基因检测与诊断
用于检测基因突变、遗传病、癌症等 疾病相关的基因序列变化，为疾病的
预防、诊断和治疗提供依据。
生物多样性研究
用于检测和鉴定物种的基因组序列， 研究物种的进化、分类和系统发育等
。
食品安全与环境监测
用于检测食品和环境中存在的有害微 生物、病毒和其他病原微生物的核酸 序列，保障食品安全和环境卫生。
探针的纯化与保存
探针的纯化
通过凝胶电泳、亲和层析等方法对标记后的核酸 探针进行纯化，去除杂质和未标记的核酸分子。
探针的保存
将纯化的核酸探针进行分装，并保存在-20℃或80℃冰箱中，以延长探针的保存时间并保持其稳 定性。
03
核酸探针的检测方法
Southern印迹法
总结词
一种将DNA从凝胶转移到膜上的方法，用于检测基因组DNA中的特定序列。
农业科研与育种
用于检测和鉴定农作物及其病原微生 物的基因组序列，研究农作物的遗传 改良和抗病育种等。
02
核酸探针的制备
目的基因的获取
01 基因组DNA提取
从生物样本中提取基因组DNA，作为制备核描述课件
目录
• 核酸探针概述 • 核酸探针的制备 • 核酸探针的检测方法 • 核酸探针的实际应用 • 核酸探针的未来发展
标记探针制备
标记探针制备
标记探针制备方法是一种用于生物学和医学研究的重要技术，它使用标记探针（例如核酸、碳水化合物或蛋白质）来克隆、检测和定位特定的DNA序列或蛋白质。
该技术在遗传学、分子生物学、转基因研究、微生物学和药物发现等领域有着广泛的应用。
标记探针制备的过程主要包括几个步骤：
1. 选择目标序列：首先，研究者需要选择他们想要克隆或检测的特定DNA序列或蛋白质序列作为标记探针的目标序列。
这可以通过搜索数据库或通过任何其他方法实现。
2. 合成标记探针：接下来，研究者可以使用任何一种合成技术（例如PCR、合成DNA或全基因组合成）来合成标记探针，以实现对特定序列的克隆和检测。
3. 加入标记物：研究者可以使用任何一种方法将标记物（如核酸、荧光素或放射性同位素）加入到已经合成的标记探针中，以便将其与特定序列区分开来。
4. 纯化探针：最后，研究者可以使用纯化技术将标记探针从其他成分中纯化出来，以便用于实验。
标记探针制备技术的使用有助于研究者更好地深入理解和研究人类基因组的结构和功能，也有助于研究者更
快、更准确地确定他们感兴趣的物种的基因组结构，从而为药物发现和基因治疗等应用提供更多有用的信息。
地高辛标记核酸探针
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
地高辛标记的探针是一种非放射性探针。
1设计 Digoxigenin 标记探针的引物。
每种血清型在保守区域设计一对通用引物。
2 标记探针合成(引物来源上述）
（1）各血清型阳性质粒模板的扩增。
（2）利用引物，通过PCR《参照罗氏公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书》，合成标记探针。
（3）电泳、回收、纯化和定量
3 核酸斑点杂交检测
（1）其他病毒核酸作对照，12种血清型PCR扩增产物。
（2）将12种探针和探针PM（混合探针）与同一血清型不同含量的核酸用常规方法进行核酸杂交。
4.显色。
核酸探针技术的原理和应用
核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。
本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。
一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。
该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。
2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。
常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。
标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。
3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。
常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。
这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。
二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。
以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。
通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。
2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。
例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。
3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。
通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。
4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。
一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。
正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。
因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
rna探针标记原理
rna探针标记原理
RNA探针标记原理是利用RNA分子的互补配对特性，通过对待检样品中的目标RNA序列进行特异性配对，然后利用荧光染料或放射性同位素等标记物标记探针，从而实现对目标RNA的检测和定量。
具体原理如下：
1. 设计探针：根据目标RNA序列，设计一段具有高亲和力的寡核苷酸或寡肽探针。
探针的序列应该与目标RNA序列互补配对，以保证特异性。
2. 标记探针：在探针序列的适当位置引入标记物，常用的标记物有荧光染料、酶、放射性同位素、生物素等。
标记物的选择应根据实验的需要进行合理设计。
3. 条件选择：根据实验要求选择合适的探针标记条件。
例如，如果选择荧光染料作为标记物，需要选择适当的荧光染料和相关荧光探针，以及适当的光源和探测器。
4. 条件优化：针对不同目标RNA序列的检测，根据实验要求对探针标记条件进行优化。
这包括标记物的浓度、反应时间、反应温度等参数的优化。
5. 实验操作：将标记后的探针与待检样品中的目标RNA进行反应。
通过互补配对，探针能够特异性地与目标RNA结合。
接着，利用适当的方法，如荧光显微镜或放射性测量，检测探针与目标RNA的结合情况。
6. 结果分析：根据标记探针的特异性，以及探针与目标RNA
的结合情况，可以判断目标RNA的存在与数量。
根据实验需要，可以使用定量方法如荧光强度测定、放射性计数等定量分析手段。
综上所述，RNA探针标记原理是通过设计和标记特异性探针，利用互补配对原理实现对目标RNA的检测与定量。
这种方法
在基因表达、疾病诊断、药物研发等领域具有广泛应用。
核酸探针的名词解释
核酸探针的名词解释核酸探针是一种生物技术工具，用于检测和定量分析某个特定的核酸序列。
核酸探针广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域，发挥着重要的作用。
本文将对核酸探针进行全面的解释和概述。
首先，核酸探针是由特定的DNA或RNA序列构成的分子探针，可以与目标核酸序列发生亲和作用。
这种亲和作用是通过碱基之间的氢键和静电相互作用来实现的。
当核酸探针与目标序列结合时，可以通过不同的手段进行检测，如荧光、放射性同位素、酶等。
因此，核酸探针可以用于检测及定量分析目标核酸的存在和数量。
核酸探针通常分为两类：探针和探针靶标。
探针是指通过标记物标记的核酸序列，用于寻找、结合和识别特定的目标序列。
标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶等，通过这些标记物的特性，可以将目标序列的存在转化为可见的荧光信号或颜色变化等。
探针的设计需要根据目标序列的特点和要求进行选择，以确保能够高效地与目标序列结合。
而探针靶标是指与探针结合的目标核酸序列。
探针靶标可以是基因、RNA、病毒等，通过与探针的结合，可以准确地检测和定量目标核酸的存在和数量。
探针靶标的选择是基于研究的目的和所需的结果，不同的探针靶标可以提供不同的信息和数据。
核酸探针的优点是具有高度的特异性和灵敏性。
由于核酸探针是专门设计的，可以针对目标序列的独特特点进行选择和设计，使其具有非常高的特异性。
此外，核酸探针的灵敏性也很高，可以检测到非常低浓度的目标分子。
因此，核酸探针常被用于疾病的早期诊断、药物研发、基因工程和环境监测等领域。
然而，核酸探针也存在一些限制和挑战。
首先，核酸探针对目标序列的特异性要求非常高，如果目标序列发生了变异或突变，可能会导致探针无法与其结合，从而导致检测结果的错误。
此外，核酸探针的设计和合成成本相对较高，需要专业的实验室和设备支持。
因此，在使用核酸探针进行研究和应用时，需要充分考虑这些限制和挑战。
目前，核酸探针已经广泛应用于各个领域。
在生命科学研究中，核酸探针常用于基因表达分析、突变检测、病毒感染研究等。
核酸探针作用的原理及应用
核酸探针作用的原理及应用引言核酸探针是一种广泛应用于生物学研究中的工具，通过与目标DNA或RNA序列的特异性互补配对，能够检测并定位特定的核酸分子。
本文将介绍核酸探针的原理和其在生物学研究中的应用。
核酸探针的原理核酸探针的原理基于DNA或RNA的碱基互补配对。
核酸分子由四种碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）（DNA中的胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）取代）。
两条相互互补的核酸链能够通过碱基配对（A与T/U，C与G）形成稳定的双链结构。
核酸探针通常由两个部分组成，一个是探针的序列，另一个是标记物。
探针的序列通常与目标DNA或RNA的互补序列相匹配，便于与目标核酸发生特异性配对。
标记物则是一种用于检测核酸探针位置的信号发出物质，如荧光染料或放射性同位素。
核酸探针的应用核酸探针在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是核酸探针的几个重要应用。
1. 基因检测和表达分析核酸探针可以用于检测和鉴定目标基因的存在和表达情况。
通过将探针与目标DNA的互补序列配对，可以检测基因的存在与否。
此外，通过标记物的选择，可以定量检测基因的表达水平。
2. 突变检测核酸探针可以用于检测DNA序列的突变。
通过与目标DNA的互补配对，如果存在突变，则配对会受到影响，从而使标记物的信号发生改变。
这种方法可以准确、快速地检测DNA序列中的单核苷酸突变。
3. 细菌和病毒检测核酸探针还可以用于检测和鉴定细菌和病毒的存在。
利用特异性的核酸探针，可以识别和定位特定的细菌和病毒序列。
这种方法在临床诊断中有着重要的应用，可以迅速判定感染的细菌或病毒种类。
4. 基因组测序核酸探针被广泛应用于基因组测序技术中。
在测序过程中，核酸探针可以与待测序的DNA相互配对，帮助确定DNA的序列。
5. 药物研发核酸探针也常用于药物研发领域。
通过设计和合成特定的核酸探针，可以筛选潜在药物分子与目标基因或蛋白质的作用。
结论核酸探针作为一种重要的生物学工具，广泛应用于基因检测、突变检测、细菌和病毒检测、基因组测序以及药物研发等领域。
综述核酸探针的标记法
二.半抗原标记
AAF标记 核酸鸟嘌呤能用A A F (N 一醋酸基一N 一乙酰氨 基芴) 进行修饰, 经修饰后的鸟嘌呤成为具有抗 原特异性的半抗原. A A F 的一种含碘衍生物A A IF 也可修饰核酸. 经A A F 修饰的核酸探针具有很好的稳定性, 在4 ℃ 下可稳定保存两年
二.半抗原标记
整理者
何苏 黄德丽
什么是核酸探针？ 核酸探针是指能与特定目标核 酸序列发生杂交，并含示踪物 的核酸片段(DNA或RNA)
基本原理
根据遗传序列的相对稳定性及其 核苷酸碱基序列的互补原则, 用已 知特异的碱基序列作成有标记的一 小段单链或核昔酸序列与被检材料 进行分子杂交。
核酸探针的标记物
放射性标记物VS 非放射性标记物
有强大荧光强度、斯托克斯位移大及发射峰窄、
寿命长等优点, 具有很高的检测灵敏度。
三.非同位素标记试剂
化学发光标记试剂
1）吖啶酯衍生物标记 吖啶酯衍生物可以直接标记在核酸探针 上 , 以它作标记物不需催化剂,标记反应不 影响其发光的量子产率, 并可选择性地分解 标记物,产生化学发光,吖啶酯衍生物的发光 可因其中的苯酚水解而完全淬灭, 因此在一 定条件下, 可以用化学的方法将未杂交探针 中的吖啶酯水解破坏, 而探针中的吖啶酯则 因插入到碱基对中受到保护
核酸探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测 新技术, 但其在实际应用中仍存在不少问题。放 射性同位素标记的核酸探针具有半衰期短、对人 体有危害等缺点, 作为常规诊断, 特别是在食品 检验实验室很不适用。生物素标记的核酸探针虽 然对人畜无害,但其不足之处在于受紫外线照射易 分解。另外, 临床标本(如食品) 中的内源性生物 素化蛋白质和其他糖蛋白类物质常引起背景加深 和非特异性反应。同时,菌落杂交的敏感性也受其 他因素的影响。但是我们相信, 随着该技术的发 展与完善, 其在食品微生物检验中将不失为一种 有效的检测技术。
核酸标记各种标记物及标记方法
1．核素标记物放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物。
放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10-14～10-18克的物质，在最适条件下可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。
常用标记核酸探针的核素有32P、3H、35S，在Southern印迹杂交中以“P最常用。
还应根据标记方法的不同选择相应标记方位的核素，一般情况下，大多数标记方法需要的是a—32P，而5，末端标记必须是r-32P。
2．非放射性标记物多年来，科学家们致力于寻找一些安全、可靠、灵敏度高的物质代替放射性核素用于核酸分子杂交，并取得了一定的进展，部分非放射性标记物已在国内外逐步推广使用。
其优点是无放射性污染，可以较长时间存放，从而更便于临床诊断等方面的应用。
但此类非放射性标记物的缺点是灵敏度及特异性都不太高。
根据其检测方法，非核素标记物可分为以下4类。
(1)半抗原：生物素(biotin)和地高辛(DIG)都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。
这两种物质是目前使用较普遍的非核素标记物。
(2)配体：生物素不仅是半抗原，故可用生物素与亲和素反应进行杂交信号的检测。
(3)荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以发出紫荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。
(4)化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以像核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。
化学发光探针可能是今后非核素标记物研究的主要方向。
三、标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法(一)切口平移法(nick translation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP 连接到切口的3′末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA 链中(二) 随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。
核酸探针的原理是什么
核酸探针的原理是什么核酸探针是一种用于检测、鉴定和定量核酸分子的工具。
它基于互补配对原理，将带有荧光标记或放射性标记的单链DNA或RNA引物与待测样品中的靶核酸特异性结合，通过检测标记物的荧光或放射性信号来确定靶核酸的存在、数量和序列等信息。
核酸探针的原理基于DNA和RNA双链分子的互补配对规则。
DNA由四种不同的碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和鳸嘧啶）组成，它们之间可以通过氢键形成配对，即腺嘌呤与鸟嘌呤之间形成两个氢键，胸腺嘧啶与鳸嘧啶之间形成三个氢键。
因此，DNA的两条链是互补的，即一个链上的碱基与另一个链上的碱基相互配对。
核酸探针通常由一条具有特定序列的单链DNA或RNA构成，并在末端或碱基上标记有荧光染料或放射性同位素等标记物。
当该核酸探针与待测样品中的靶核酸序列互相配对时，标记物会被激活并发出荧光或放射性信号。
这种信号可以通过荧光显微镜或放射性计数器等设备被检测、记录和分析。
核酸探针的选择是十分重要的，它们必须与待测样品的靶核酸序列具有高度的亲和力和特异性，以确保检测的准确性和灵敏度。
核酸探针的设计通常基于目标序列的已知信息，通过比对目标序列与其他相关序列的异同，确定具有高度亲和力和特异性的引物。
此外，核酸探针的长度、配对性及标记物的选择也会影响探针的灵敏度和特异性。
核酸探针技术在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用。
例如，在基因检测中，核酸探针可以用于检测特定基因变异或突变，从而确定个体是否患有遗传疾病；在病毒学研究中，核酸探针可以用来检测和定量病毒的存在和数量，帮助诊断和治疗病毒性感染；在环境监测中，核酸探针可以用于检测和鉴定水体、土壤和空气中的微生物和有害物质等。
总之，核酸探针是一种基于互补配对原理的检测工具，借助于标记物的信号可以检测、鉴定和定量待测样品中的靶核酸分子。
它在生物医学研究、临床诊断和环境监测等领域具有重要的应用价值。
核酸探针标记
二、探针的标记物
理想的标记物：敏感度高；特异性强； 不影响探针分子的主要理化特性；标记、 检测方法简单、探针保存时间长；对环 境无污染、对人体无损害；价格低廉。 一）放射性标记物 二）非放射性标记物
（一） 放射性标记物 ----放射性核素
利用放射性核素能产生射线的特性将核 素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP 上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中 去制成探针，与待测的核酸杂交后，核 素产生的或射线可使底片感光的特性， 通过放射自显影的方法进行检测。 产生射线的核素：32P、3H、35S 产生射线的核素：125I
1）生物素：1-2pg 生物素化核苷酸：bio-16-dUTP bio-11-dUTP 生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素酶的复合物—加底物—显色 光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生 物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光 的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素 标记的 探针
（一）缺口翻译法或切口平移 （nick translation）
5‘
3‘
5’ 5’-3外切酶和5’-3 内切酶 3’ 5’
3‘
限量DNA酶I 5‘
DNA聚合酶I+ 32P-dNTP
5’ 3’
变性
32P部分标记的
单连DNA片段
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一 条连上产生若干个单连缺口 利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的 活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末 端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加 一个核苷酸，以修补缺口。 随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸 就掺入到新合成的DNA连中
核酸标记用途
核酸标记用途核酸标记是一种在细胞或组织中使用特定的标记物来标记和检测核酸分子的技术。
该技术广泛应用于生物学、医学和生物工程领域，在疾病诊断、药物研发、基因表达和蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用。
核酸标记可以通过多种方式实现，如荧光标记、酶标记和放射性标记等。
在生物学研究中，核酸标记可以用于检测和定量某种特定核酸分子的存在和表达水平。
最常用的核酸标记方法之一是荧光标记。
通过将荧光染料与核酸结合，可以在显微镜下直接观察和定量特定的核酸序列、基因表达水平以及细胞和组织中核酸的定位和分布情况。
例如，在研究基因表达调控机制的过程中，可以利用荧光标记的探针来研究特定基因的表达水平和调控路径。
在医学诊断中，核酸标记可以用于检测病原体的存在和病情的评估。
例如，在传染病的早期诊断中，可以利用核酸标记的技术来检测和定量细菌、病毒和寄生虫等病原体的核酸分子。
这种技术可以提供高度敏感和特异性的诊断结果，并且可以通过多重检测来识别多种病原体的存在。
此外，核酸标记还可以应用于肿瘤的诊断和治疗监测，通过检测肿瘤细胞中特定基因或突变序列的存在和表达水平，可以为肿瘤的早期诊断、治疗选择及预后评估提供重要依据。
在药物研发方面，核酸标记可以用于评估药物分子的靶向性和效果。
药物靶点的选择和效果评估对于药物研发非常重要。
核酸标记可以通过标记药物分子，来研究它们与特定的核酸序列或结构的相互作用。
这种技术可以帮助科学家了解药物的作用机制、药物分子与靶分子的结合亲和力以及药物在转运、代谢和解毒方面的特性。
这对于高效选择药物靶点、开发新型药物以及评估药物的药效和副作用具有重要的意义。
在基因表达和蛋白质相互作用研究中，核酸标记可以用于检测和定量特定基因和蛋白质的表达水平和相互作用。
例如，核酸标记可以通过标记某个基因的mRNA，来观察该基因的表达动态变化；另外，核酸标记还可以通过标记蛋白质的mRNA 或DNA序列，来研究蛋白质合成和翻译的机制以及蛋白质的功能和相互作用网络。
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硷基
OOO
H H(OH)
2、放射性标记物的优缺点
优点：灵敏度高：0。01pg
半衰期短，不能长期保存
二）非放射性标记物
1、优缺点
优点：无放射性污染
成本低、操作简单
缺点：敏感性、特异性均低于放射性核
素
2、常用的标记物
1）生物素：1-2pg
生物素化核苷酸：bio-16-dUTP
（一）缺口翻译法或切口平移 （nick translation）
5‘ 3‘
5’
3’ 5’
3‘ 限量DNA酶I 5‘
5’-3外切酶和5’-3 内切酶
5’ 3’
DNA聚合酶I+ 32P-dNTP
变性
32P部分标记的 单连DNA片段
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一 条连上产生若干个单连缺口
酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜
（二）随机引物法（random priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用
E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段 （仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶 的活性）
产生射线的核素：32P、3H、35S
产生射线的核素：125I
1、常用的放射性核素
1） 32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最 常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）： 位和位标记。
2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感 度底
O(S) O(S) O(S)
OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O
生物素化的核苷酸和 光敏生物素
生物素 光敏基团
2）地高辛甙元
Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶 的复合物—加底物—显色
灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移法 （二）随机引物法 (三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记 （五）RNA探针的标记
bio-11-dUTP
生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素酶的复合物—加底物—显色
光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生 物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光 的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素 标记的 探针
连cDNA探针）
（五）RNA探针的标记（体外转录的方 法）
第10章 核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization)
基本原理：具有一定同原性的两条核酸单 连在一定条件下（适当的温度、离子强 度等），按硷基互补的原则，重新形成 双连DNA的过程。
杂交的类型：
液相杂交：核酸电镜
固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原
3’——————5’OH +32P-P-PA(ATP）
T4多核苷酸激酶
————————5’32P+PPA
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation）
（二）随机引物法（random priming )
(三）末端标记法
（四）cDNA探针的标记（反转录制备单
极易降解，不宜操作。
二、探针的标记物
理想的标记物：敏感度高；特异性强； 不影响探针分子的主要理化特性；标记、 检测方法简单、探针保存时间长；对环 境无污染、对人体无损害；价格低廉。
一）放射性标记物 二）非放射性标记物
（一） 放射性标记物
----放射性核素
利用放射性核素能产生射线的特性将核 素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP 上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中 去制成探针，与待测的核酸杂交后，核 素产生的或射线可使底片感光的特性， 通过放射自显影的方法进行检测。
随机引物法标记的原理
变性后的探针DNA或RNA与随机引物混 合
随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合
DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物 3’-OH端开始合成互补DNA连
反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记 的DNA探针
5‘
3‘
双连
变性
DNA
3‘
随机引物
3‘
Klenow大片段 32P-dNTP
位杂交、菌落原位杂交
一、膜固相印记杂交
（一）固相支持物的选择 １、硝酸纤维素膜： 在高离子强度下，具有较强的吸附单
连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2 ２、尼龙膜：在低离子强度下，很强的
利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的 活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末 端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加 一个核苷酸，以修补缺口。
随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸 就掺入到新合成的DNA连中
缺口翻译法的特点
1）快速、简便、标记的探针均一、特异 性高
2）仅适用于较长的双连DNA 3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚
5‘
变性
随机引物标记法
随机引物法的特点
1）不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记
2）操作简单 3）标记率高
(三）末端标记法
末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase)
5’——DNA——3’OH+-32 p-dNTP
第9章 核酸探针标记 （label of nuclei acid probe ）
一、探针的类型
核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物 标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作 用的DNA或RNA片段。
1． 基因组DNA探针：病毒DNA等 2． cDNA探针；最常用 3． 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变 4． RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA
末端转移酶
5’________DNA___________3’(pdN)n +nPPi (焦磷酸） T4多核苷酸激酶法（method of T4
polynucleotide kinase)
(三）末端标记法
T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)