电镜技术一
形态学研究中的扫描电镜技术
形态学研究中的扫描电镜技术形态学是生物学的一个重要分支。
它研究生物体的形态结构，包括细胞、组织、器官、生物体等。
形态学的研究方法主要包括显微技术、电镜技术等。
其中，扫描电镜技术被广泛应用于生物形态学的研究中。
一、扫描电镜技术的概述扫描电镜技术是一种高分辨率的电子显微镜技术，它可以在非真空下对样品进行观察。
扫描电镜将电子束定向向样品表面扫描，然后通过对扫描电子的反射、散射和吸收来诱发样品表面的二次电子发射。
这些二次电子被探测器捕获并转化为图像。
扫描电镜技术可以提供高分辨率和三维图像，同时不需要对样品进行切片和染色。
因此，扫描电镜技术被广泛应用于生物学、材料科学、化学等领域的研究中。
二、扫描电镜技术在生物形态学研究中的应用1. 细胞结构研究扫描电镜技术可以用于研究细胞表面的形态结构，以及各种微细结构的形态变化。
例如，用扫描电镜观察红细胞可以看到其表面的微细绒毛和凹陷。
2. 组织学研究扫描电镜技术可以帮助研究活体组织、细胞和器官的形态结构。
解剖学家和生物学家可以使用扫描电镜技术来描绘人体各个组织和细胞的形态，制作出许多精美的三维影像。
扫描电镜也可以用于观察细胞的超微结构，例如细胞核、线粒体等。
3. 功能性研究扫描电镜技术可以用于研究生物体内的神经和感觉器官等功能性结构。
例如，使用扫描电镜可以观察蛇的毒牙和水母的刺细胞等功能性结构。
4. 疾病研究扫描电镜技术可以用于研究疾病的发生、发展和治疗。
例如，使用扫描电镜可以观察癌细胞的表面形态和结构变化。
5. 物种分类研究扫描电镜技术可以帮助研究不同物种的形态结构差异，从而推断它们之间的亲缘关系。
例如，使用扫描电镜可以观察昆虫体表的微结构和毛发，推断它们的物种分类。
三、扫描电镜技术应用的局限性1. 样品制备的困难扫描电镜技术需要对样品进行制备，包括表面覆膜、清洗、干燥等。
制备样品的过程需要精密的仪器和操作，并对样品进行高度的保护，以保证扫描电镜观察到的是样品的真实表面形态。
电镜技术-第6次课
在水面上。
水槽分金属(或工程塑料)和胶布水槽两种，前
者可反复使用，后者是用长约 4cm、宽约 0.6cm 胶布
条贴在刀口上制成。制好胶布水槽后，再用熔化的
熟石蜡封好接口，以防漏水。
幻灯片 22 幻灯片 23
钻石刀 钻石刀又称金刚刀，它具有以下优点：其刀口在室温下不存在氧化和分子重新排列问题， 可反复使用，节约了制取玻璃刀的大量时间；可切割各种软硬度的样品，尤其适用千特别 硒的材料；刀口范围大，可切割出较大的切片；刀锋不易损伤，故可用于连续切片；刀锋 锐利，一般无刻痕，可得到 10~20nm 平整满意的 切片。 由于钻石刀价格昂贵，且易碰撞受损，所以使用时务需注意以下事项:缺少熟练使用玻璃刀 经验者，不要使用钻石刀;可用玻璃刀切片的样品，尽量不用或少用钻石刀;钻石刀的刀刃 切勿手摸，安装时要用特制的刀架， 其刀刃不能碰及硬物;包埋块游离端的表面积不得大 于 lmm２;切硬度较大的样品时，其切片厚度应小于 100nm;切速选择一般为 lmm/秒，最大不 要高于 2mm/秒(切 速是指刀锋通过包埋游离端的速率）;用完后要立即清洗，滤纸吸干后妥 善保存。 5、切片一般透射电镜观察样品时，电子束无法穿过 0.１μm 以上的切片，所以需将样品切 成 10~50nm 的薄片才能观察，与光镜观察的 3~7μm 切片对比而言，常将透射电镜的切片称 为超薄切片。目前透射电镜观察最合适厚度为 30~40nm 之间。为制取此类切片而设计的切 片机称超薄切片机。 (1)、超薄切片机超薄切片机按其设计的推进原理，可分为机械推进式和热膨胀推进式两类。 目前国内使用较多的是瑞典 LKB 系列热膨胀推进式超薄切片机。不同型号的超薄切片机虽 然操作方式各不相同，但其切片原理都基本相同。所有切片机在切片过程中，都是使一个 装有样品块的活动臂上下运动并通过刀刃，在活动臂每次下降切片 之前均对着刀刃作微小 的推进，这样便便一极薄的切 片从样品块表面被切割下来。刀上有一装有液体的小水槽、 脱落下来的切片悬浮在小水槽的液面上。
免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术是一种结合了免疫学和电镜学的高级技术，它可以用来检测细胞和组织中的蛋白质、抗原和抗体等分子。
免疫电镜技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合来标记细胞或组织中的分子，然后通过电镜观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的步骤包括样品制备、抗体标记和电镜观察。
首先，需要将样品制备成超薄切片，通常使用冷冻切片技术来保持样品的原始结构和形态。
然后，将抗体与标记物结合，通常使用金粒子或荧光染料等标记物来标记抗体。
标记后的抗体可以与样品中的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，使用电镜观察样品中的标记物，可以通过电镜的高分辨率来观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的优点是可以在细胞和组织水平上观察分子的位置和形态，可以提供高分辨率的图像，可以检测低浓度的分子，可以检测细胞和组织中的多种分子。
但是，免疫电镜技术也存在一些缺点，如样品制备复杂、标记物选择有限、标记效率低等。
免疫电镜技术是一种重要的生物学研究技术，它可以用来研究细胞和组织中的分子，可以提供高分辨率的图像，可以帮助我们更好地理解生物学现象。
生物冷冻电镜的技术及应用
生物冷冻电镜的技术及应用随着生物学的发展，现代科学对生物结构和功能的研究已经到达了一个新的高度。
其中，冷冻电镜成为了生物结构研究中不可或缺的重要技术手段。
与传统的电镜技术不同，冷冻电镜技术可以使生物样品在冷冻状态下被固定，不失真和干扰，从而更为准确地观察和研究生物体内各种微观结构，尤其是高分子复合物的结构与互作。
一、冷冻电镜技术的基本原理冷冻电镜技术是通过将生物样品在快速冷冻的状态下迅速固定，避免样品在固化过程中产生化学反应，从而保持了样品在自然状态下的形态结构。
通常，样品的冷冻速度可达到10000-60000℃/s，减少了溶剂结晶对样品的损伤。
电子显微镜可以将冷冻过程的各个环节迅速观察和记录下来，尤其是高分子复合物的高分辨率成像，更好地反映了样品的自然结构。
二、冷冻电镜技术的发展历程冷冻电镜技术自1950年代开始，随着电子显微技术的发展不断完善和改进，鲜明的发展成果已经在现代生物学研究中不可忽视。
1950年代，人们通过旋转模型来模拟生物大分子的三维结构。
60年代初期，Patrick Boyer首次使用冷冻电镜研究鱼的肌肉组织，成功地观察到鱼肌纤维，开创了冷冻电镜领域新的历史篇章。
随后，人们开始使用冷冻技术尝试研究生物样品，1967年，探针技术的出现被认为是冷冻电镜技术具有突破性进展的标志。
1980年代，高分辨率微镜的发明，使得冷冻电镜技术的分辨率被提高到0.2奈米级别。
随着技术的发展，冷冻电镜技术已成为人们研究微生物学、生物医学和生物工程学等领域不可或缺的技术之一。
三、冷冻电镜技术的应用冷冻电镜技术广泛应用于从分子结构到大分子复合物的细胞研究，已经成为各种生物学领域的重要技术手段。
当下，主要的应用领域包括：1、细胞结构研究。
冷冻电镜技术是观察细胞组织和细胞配件的理想手段，可以在非常高的空间解析度下获取细胞超结构的实时图像，增强细胞结构研究的深度和广度。
2、蛋白质与生物大分子的研究。
冷冻电镜技术可直观地观察高级生物大分子的结构，从而使生物高分子结构和功能的研究更加精确和深入。
电镜技术-第7次课
稀释，悬浮病毒的缓冲液应尽可能稀一些。较浓的缓 冲液会使载网上产生许多盐类的结晶而影响图象的质 量。缓冲液较浓时，宜先用双蒸水稀释。
3.负染用的载网支持膜(尤其是碳膜)，有时
因疏水性的影响沾样后会形成一个球形液珠，用 滤纸一吸即全部吸光，样品难以附着在支持膜上。 遇到这种情况，先用离子溅射仪对载网进行亲水 处理，改善支持膜的亲水性。
2.细菌培养物
可用白金丝接菌环在斜面培养基上刮取少许菌苔 于双蒸水中配成悬液。若观察鞭毛，须用不超过24 小时培养的新菌落，直接在培养物中加入双蒸水， 细菌自动游动悬浮起来便可进行负染观察。
3.动物病毒组织培养物
应进行浓缩以增加病毒的检出率。例如，大多数 粘液病毒和副粘液病毒可用红血球吸附法浓缩，方 法是将病毒培养物与红血球等量混合，静止5分钟， 使病毒吸附于红血球表面，然后以80Orpm离心15分 钟，沉淀用生理盐水悬浮，在冰箱中放3~4小时，病 毒即从红血球表面释放到上部溶液用。所用双蒸水 和生理盐水均需灭菌。
5.硅钨酸
性能类似于磷钨酸，在中性偏碱性情况下使用可 以更好地显示出病毒颗粒的细微结构，一般配成1~2% 的水溶液。
负染色液PH值对染色效果的影响
负染色液的PH值对负染效果有较大的影响，一般偏 酸的染液能获得较好的染色效果，越是偏碱效果越差， 碱性染液往往造成生物标本的凝聚变形。
通常磷钨酸盐的PH值在6.0~7.0，比较容易获得较 好的效果。磷钨酸及其盐类的水溶液一般是偏酸的，常 用lN的NgOH将pH值调到6.0~7.0。醋酸铀和甲酸铀的PH 值在4.0~5.2较好，常用氨水和盐酸来调节pH值。
3.甲酸铀
特别适合于具螺旋对称的病毒颗粒，能显示出病 毒的蛋白质亚基结构。一般配成0.5~1%的水溶液，甲 酸铀极不稳定，只能临用前配制，不宜保存。
电镜的图像处理技术
电镜的图像处理技术电子显微镜（简称电镜）是一种高科技装置，可以高精度地观察物质微观结构，它的出现推动了纳米科学、纳米技术的不断发展。
在电镜取得的图像中，图像处理技术可以为我们提供更多的细节信息，让人类更好地认识和利用物质世界，将在此阐述一些常用的图像处理技术。
1、对比度调整调整对比度可以使图像更加清晰，让目标物体的特征更加明显。
电镜的图像通常比较暗淡，如果不进行对比度调整，会很难看清物体的表面结构和内部形态。
为此，我们需要使用图像处理软件，在里面打开电镜图像，通过调节对比度和亮度等参数，使得图像更加明亮、细节更加清晰。
2、去噪电镜图像通常包含噪声，在处理图像前，我们需要把噪声移除，这可以通过各种滤波算法来实现。
常用的去噪算法有中值滤波、高斯滤波、维纳滤波等。
中值滤波将每个像素的值都改为周围像素的中值，具有去除噪声的效果；高斯滤波是一种基于像素点附近值的加权平均值的算法，可以消除高频噪声；维纳滤波可以对加性噪声进行去噪。
3、边缘检测边缘检测是图像处理中的一种常见操作，它可以帮助我们寻找图像中各个物体的边缘。
在电镜图像处理中，边缘检测可以帮助我们更加清晰地观察物体的表面形态和内部结构。
常用的边缘检测算法有Canny算法、Sobel算法、Laplacian算法等。
这些算法都可以在图像中寻找边缘，并将其以线条的形式标记出来，方便我们分析和研究。
4、三维可视化在电镜实验中，我们经常需要观察物体的三维形态，这可以通过三维可视化技术来实现。
在图像处理软件中，我们可以将电镜图像进行三维建模，然后通过旋转、拉伸等操作，让物体的三维形态更加清晰地呈现出来。
此外，还可以使用虚拟现实技术来进行三维可视化，让用户身临其境地观察物体的微观结构。
5、人工智能技术辅助分析随着人工智能技术的不断发展，电镜图像处理也不再局限于传统的方法，人工智能技术在其中扮演越来越重要的角色。
比如，我们可以使用卷积神经网络等深度学习技术来自动识别物体的形态、结构等信息，帮助我们更快速地进行图像分析和处理。
免疫电镜技术
组织或游离细胞内抗原
• 需对样品进行特殊处理－增加膜的通透性 固定剂+1%Triton X100，10-20min 0.1MPB冲洗，10min 0.5% 1%Triton X100，30min 0.1MPB冲洗，10min －接包埋前法标准程序
包埋后法：
• 适用： 组织细胞（内或外）抗原 游离细胞内部抗原
• 预先冷却好全部用具
3. 浸透与包埋
[目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 低温包埋剂：丙稀酸类，水溶性
不含环氧基 低温下可聚合 两种： Lowicryl K4M(德国)：紫外线照射下聚合 LR White(英国)：55 ℃ 聚合,不需紫外线照射
低温(0-4℃)聚合，需用加速剂
低温包埋剂（Lowicryl K4M）
• 常规电镜：形态结构 • 免疫学方法： 组分 • 免疫电镜：形态结构+组分
免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫化学技术与电镜技术结合的产物
在超微结构水平定位某些分子: Ag, 受体
Pancreas
Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS 113: 506–12, 2005
• 制备免疫电镜超薄切片 免疫标记
免疫电镜超薄切片的制备
• 低温包埋超薄切片法 • 冰冻超薄切片法
1.冷固定
• 取材 • FA+GA固定液中4°C， 2~3h(中间1-2h可取
出修块) • 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）
4°C， 2h • 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过
• 羟丙基/甲基丙烯酸酯（基本成分） • 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） • 苯甲酸烷基乙醚（激活剂,引发剂）
电子显微镜技术详细介绍
分辨率（resolution）
表示人眼和光学仪器能够辨别两点 之间最小距离的标志。
两点间的距离越小，表示： 分辨率 ？ 仪器所能分清被观察物体的细节 ？
分辨率是衡量电镜性能的重要指标
分辨率（resolution）
人眼分辨率 光镜分辨率 电镜分辨率
0.2毫米（mm） 0.2微米（µm） 0.2毫微米（nm）
电子显微镜的基本类型
✓透射电子显微镜(sransmission electron microscopy) ✓扫描电子显微镜(scanning electron microscopy) ✓分析电子显微镜 (analytic electron microscopy) ✓高压电子显微镜 (high voltage electron microscopy) ✓冷冻电子显微镜 (cryo- electron microscopy)
血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体 或死亡后缺氧引起自发性的变化影响。
特别是对脑、心肌、肾脏等对 缺氧比较敏感的组织尤为重要
不同动物、不同组织对灌注中压力和速度的要求不同
灌注压力 灌注流量 （mmHg） （毫升/分）
肾
120～140
9～10
睾丸
200～220
单颗粒技术
电子断层成像技术
（Single Particle Technique ） （Electron tomography）
单颗粒技术 （Single Particle Technique ）
单颗粒技术（Single Particle Technique ） 膜蛋白TRPV1颗粒
电子断层成像技术（Electron tomography）
电子显微镜技术 （electron microscope）
生物电镜技术
一般15000倍以下的图像为低倍像。低倍像调正焦点，多使用图像摇摆器(wobbler)，目前多数电镜装备此种装置。它有两组偏转线圈组成，在偏转线圈上通50周/秒的交流电，使用时照明束以样品平面上的一点为中心来回摆动。当物镜处于正焦点时，对于样品平面上的一点任意方向发射的电子到像平面还是一点
到1934年——电子显微镜的分辨率提高到50nm，放大倍数达到1万倍。这就是电子显微镜的初型设计阶段。
1935年电子显微镜基本定型。
1939年德国西门子公司生产了世界上第一批作为商品的透射式电子显微镜，分辨率优于10nm，放大倍数达到10万倍。
60年代——透射式电子显微镜的分辨率达到0.5nm。
70年代末——电子显微镜的点分辨率已优于0.3nm，晶格条纹分辨率达到0.14nm。实现了人们早就向往的对原子像和晶格像的观察。
较薄的样品为了提高反差选用较小的光阑孔。
6．样品的安装
安装样品是一件较容易的事，但并非是不重要的事。它的操作关系到图像的分辨率，为此安装样品时要求：手不能触摸进入真空系统的部分。以免手上的水分或脏物进入电子光学系统。
放样品时要摆正放平，使载网与样品夹持器或样品杯接触良好，保证有良好的热传导，防止样品热漂移。
有以电子枪类型区分的，如钨灯丝电镜、场发射电镜；有以用途区分的，如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、双束扫描电镜(FIB)等。
有以激发的信息命名的，如电子探针X射线微区分析仪(简称电子探针，EPMA)等。
二、透射电镜的基本原理
就最基本的原理来说，透射电镜和光学显微镜是相同的，它们的显微放大过程基本相似，而且电镜的光路和部件术语也同光镜基本一样。不同的是，电镜的照明源不是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，并且电子显微镜的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。
冷冻电镜成像技术的原理和应用
冷冻电镜成像技术的原理和应用冷冻电镜成像技术是一种高分辨率的成像方法，它能够在不破坏样本天然结构的情况下，提供比传统电镜更高的分辨率。
随着科学技术的不断进步和发展，冷冻电镜成像技术在生物领域、材料科学领域以及纳米技术等领域得到越来越广泛的应用。
一、冷冻电镜成像技术的原理冷冻电镜成像技术的原理可以简单地理解为将样本快速冷冻并冻存，使其原来的结构保持不变，然后在极低温下使用电子束成像。
这种技术的优点是，由于样本受到的损害极小，因此可以提供非常高的分辨率，并且可以得到非常清晰的3D图像，从而使得研究者可以更好地理解样本的内部结构和特性。
冷冻电镜成像技术的具体原理如下：1. 样本制备在采集样本之前，需要先进行样本制备。
通常使用的样本是生物样本或材料样本，比如蛋白质、病毒、胶体等。
将样本制备过后，需要快速冷冻并冻存样本，以保证样本的结构不会受到损害。
2. 冷冻过程在将样本冻结之前，需要先将样本放置在一层非常薄的网格上，网格可以是金属或碳质的。
然后将网格压在常温下的液体乙烯和丙烯溶液中，通过连续的过滤和干燥过程，将样本涂上一层非常薄的碳膜。
之后使用液氮快速冷冻样品，并在液氮中进行冻存，以防止样品受到氧化。
3. 成像过程冷冻样品需要在极低的温度下进行电子显微镜成像，通常在-180至-190℃的温度下进行。
通过电子束，扫描样品表面，从而确定样品的形状和结构。
得到的数据在计算机中被处理，从而生成最终的成像结果。
二、冷冻电镜成像技术的应用冷冻电镜成像技术被广泛应用于生物领域、材料科学领域以及纳米技术等领域。
特别是在生物领域，冷冻电镜成像技术的应用非常广泛，如下所示：1. 直接成像生物分子冷冻电镜成像技术可以用来成像大量的生物分子，比如蛋白质、病毒、细胞等。
通过高分辨率的成像，可以直接观察到这些生物分子和细胞的细节结构，并且准确地推测它们的功能和作用。
2. 研究膜蛋白的结构膜蛋白是非常重要的生物分子，它们扮演了细胞膜功能中的关键角色。
免疫标记电镜技术
免疫标记电镜技术
（1）原理：是利用电镜下可见的示踪标记物标记特异性抗体（或抗原），使之与组织超薄切片中的相应抗原（或抗体）反应，形成不溶
性免疫复合物，用电镜观察可见的标记物，间接证实免疫反应的发生。
（2）常用的免疫标记电镜技术：
①铁蛋白标记免疫电镜技术：抗体与铁蛋白通过低分子量的双功
能试剂结合为一种双分子复合物。
②酶标记免疫电镜技术：是以酶作为抗原抗体反应的标记物，与
相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。
包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶-抗过氧化物酶技术（即PAP 法）。
③胶体金标记免疫电镜技术：是利用胶体金在碱性环境中带有负
电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。
当用金标记的抗体
与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需外加染色。
电镜发展史
自从光学显微镜出现以后，人类打开了微观世界的大门，看到了很多用肉眼所看不到的微小物体，例如细胞、细菌等，使人眼睛的分辨力由 0.2mm 提高到 0.2 μ m 。但是，光学显微镜由于光线波长的限制，它的分辨极限是 0.2 μ m ，有效放大倍数最高不超过 2000 倍，如果想要看到更小的物体，它就无能为力了。
从 20 世纪 30 年代开始，人们利用工业技术的发展，成功地研制了电子显微镜，它的出现，使人们能在超微结构或原子的尺度上观察研究物体的结构，人们的观察从宏观世界进入了超微结构或原子级的微观世界。 与许多伟大的发明一样，电子显微镜的发明，也经历了那个时代艰苦的历程。在光学显微镜发明长达 300 年的时间里，由于光波波长的限制，直接限制了光学显微镜的分辨能力，始终难以突破 1000 倍的放大倍数。寻找更短波长的光源成为了科学家们呕心沥血的漫长征程。
Hale Waihona Puke 自从 1938 年第一台电镜在德国问世以来，在短短的几十年时间里，电镜技术取得了飞跃的发展，在医学、生物学、材料学、地质学、考古学、天文学等许多领域中得到了广泛的应用。在现代医学、细胞超微结构、分子生物学、基因组学等学科的迅速发展，出现了更适合生物医学研究的新型电镜。
在生命科学方面，电镜的应用为阐明组织细胞的结构和功能起了巨大的作用，已成为医学科学研究和临床疾病诊断的重要工具。随着科学技术的不断发展，电镜样品制备技术也得到飞速发展。在透射电镜超薄切片基础上，又相继出现负染色技术、电镜放射自显影技术、免疫和细胞化学技术、电镜核酸原位杂交技术等；在扫描电镜常规技术基础上，也出现了冷冻割断技术、蚀刻复型技术、管道铸型技术、电子探针技术等。 在透射电镜原有的基础上安装各种测试仪器如能谱仪（ EDX ）、波谱仪（ WDX ）等，出现了各种分析型透射电镜；还有加速电压在 200kV 以上的 高压电子显微镜以及加速电压在 500Kv 以上的超高压电子显微镜；由于压电传感器的发明，使得机械探针的定位性增强，出现了扫描探针显微镜系列（包括 扫描隧道显微镜、原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、扫描热显微镜、静电力显微镜等十几种类型），其中在生命科学中应用较多的是扫描隧道显微镜、原子力显微镜和激光扫描共聚焦显微镜。
单粒子冷冻电镜技术
单粒子冷冻电镜技术
单粒子冷冻电镜技术是一种基于透射电子显微镜（TEM）的技术，可以在低温和高真空环境下对生物大分子进行成像，以观察它们的结构和动力学行为。
该技术的主要优势在于可以在接近生物大分子的自然状态下进行观察，避免了因化学固定或冷冻干燥等处理过程而导致的结构变形。
单粒子冷冻电镜技术的基本原理是将生物大分子样品在液氮温度（-196℃）下冷冻，然后将其转移到透射电子显微镜中进行成像。
在透射电子显微镜中，电子束穿过样品，与样品中的原子相互作用，产生二次电子、背散射电子等信号，这些信号被探测器收集并转化为图像。
通过单粒子冷冻电镜技术，科学家们可以获得生物大分子的高分辨率图像，包括原子分辨率和分子分辨率的图像。
这些图像可以提供生物大分子的三维结构信息，包括它们的原子排列、分子构象、蛋白质-蛋白质相互作用等。
此外，单粒子冷冻电镜技术还可以用于研究生物大分子的动力学行为，如分子运动、蛋白质折叠等。
单粒子冷冻电镜技术是一种非常强大的技术，可以提供生物大分子的高分辨率图像和动力学信息，为生命科学和医学研究提供了重要的工具。
fib电镜原理
fib电镜原理电子显微镜（EM）是一种用来研究物质的结构的技术，和光学显微镜不同，它使用的是电子束而不是光束来照射样品。
电子束的波长比光束短得多，因此EM可以提供更高的分辨率和更详细的细节。
其中之一是FIB（离子束刻蚀仪）电镜，它的工作原理将在下文中进行介绍。
1. 离子束刻蚀仪（FIB）FIB是一种非常高级的显微镜技术，它将离子束用于制造微小零件或探测细微结构。
离子束产生的气体中包含粒子，这些粒子在物质表面上产生化学反应，使表面化学成分变化，并在精确的位置上制造纳米细节。
这种技术被广泛应用于生物和材料科学，FIB的原理和过程将在下面解释。
2. FIB的工作原理透过FIB的电子透镜，被加速的离子束以非常高的速度轰击物质表面，与所处位置的原子进行碰撞。
当碰撞发生时，离子会把表面的原子从样品中移除。
这样可以制造非常小的孔洞或者精细的图案。
由于离子在物质中的穿透性比电子更高，因此它可以刻划出一些特定形状的细节，比如说直线，弯曲、尖角和滑动痕迹。
这样就可以制造出复杂的微小零件，以及非常详细的图案。
FIB电镜结合了离子束刻蚀和电子显微镜两种技术。
在这种技术中，用离子束对样品进行表面刻划，然后使用电子显微镜来观察刻标的细节。
通过这种方式，研究人员可以探查非常细密的结构，并确定它们的化学成分。
电子显微镜通过使用电子束来观察样品，而非光束。
通过这种方式，可以得到非常高的分辨率，并且可以观察到非常小的结构，甚至可以看到原子的排列顺序。
4. FIB电镜在材料科学中的应用FIB电镜技术广泛应用于材料科学，包括表面工艺、制造成像、材料性能研究以及器件结构确定等领域。
通过使用FIB电镜技术，可以进行非常精细的零部件制造，这些称为纳米结构。
这种技术在电子器件、材料分界面问题和纳米材料研究等领域中非常有用。
另外，FIB还被用于推进生物科学，例如蛋白质表征和细胞成像等领域。
材料科学中的原位电镜技术
材料科学中的原位电镜技术原位电镜技术是一种在电子显微镜中进行的实时观察材料的方法。
它可以帮助我们更好地了解材料在作用力、温度和环境变化下的行为。
在材料科学领域，原位电镜技术被广泛应用于理解材料的微观机制和结构，进而提高材料的性能和应用。
一、原位电镜技术原位电镜技术是一种通过在电子显微镜中观察材料的实时行为的方法。
它可以允许使用者对材料在不同条件下的行为进行直接观察，例如在受到力、温度和环境变化时。
这项技术是通过支持超高分辨率的显微镜和可以控制样品的实验室设备来实现的。
原位电镜技术通常分为两种类型：透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM原位电镜可以用于研究结构和成分的变化，例如晶体生长和纤维的制备。
而SEM原位电镜通常用于观察表面和界面的变化，例如微观机组件和聚合物的合成。
二、在材料科学中的应用原位电镜技术已被广泛应用于材料科学领域。
这是因为原位电镜技术可以帮助研究者更好地了解材料在不同环境下的行为和性能。
例如，原位电镜技术可以用于分析固体材料的动力学行为。
使用电子显微镜可以观察材料的结构和成分的变化，从而更好地理解化学反应和物理变化的机制。
这可以帮助提高材料的机械和化学性能，并且可以为新材料的发明和开发提供更多的启示。
不仅如此，原位电镜技术还可以被用于研究材料在高温环境下的熔融过程。
例如，对锂离子电池的研究表明，在充电和放电过程中，电池的材料会发生相变。
而使用原位电镜技术可以观察材料在这些相变过程中的结构和成分变化，有助于更好地了解锂离子电池的性能和寿命等问题。
另外，原位电镜技术还可以被用于研究材料的断裂和磨损行为。
例如，在轮胎和飞机材料的研究中，原位电镜技术可以揭示材料如何在受力时产生裂纹、变形和磨损。
这可以帮助设计更好的材料，并且可以为材料在极端环境下的使用提供更多的指导。
三、未来发展前景原位电镜技术已经成为材料科学研究的重要工具。
未来，随着电子显微镜的不断发展，原位电镜技术将变得更加准确、灵活和可控。
电镜技术练习题及参考答案
电镜练习题及答案一、透射电镜标本取材的基本要求并简要说明。
答：取材的基本要求如下：组织从生物活体取下以后，如果不立即进行及时固定处理，就有可能出现缺血缺氧后的细胞超微结构的改变，如细胞出现细胞器变性或溶解等现象，这些都可造成电镜观察中的人为假象，直接影响观察结果分析，甚至导致实验失败。
此外，由于处理不当造成组织微生物污染，导致细胞的超微结构结构遭受破坏。
因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，取材成败是关键，取材成功的关键在于操作者必须要注意把握“快、小、冷、准”四个取材要点。
(1)．快：就是指取材动作要迅速，组织从活体取下后应在最短时间 (争取在1～2分钟之内)投入前固定液。
对于实验动物，最好在断血流、断气之前就进行取材，以免缺血缺氧后使细胞代谢发生改变而破坏细胞的超微结构。
当然，最好是采用灌注固定法。
为了使前固定的效果更佳，组织块要充分和固定液混合，应采用振荡固定10分钟以上，有条件的可采用微波固定法固定。
(2)．小：由于常用的固定剂渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
因此所取组织的体积要小，一般不超过1mm3。
为便于定向包埋，可将组织修成大小约1mm×1mm×2mm长条形。
(3)．冷：为了防止酶对自身细胞的酶解作用，取材操作最好在低温(5℃～15℃)环境下进行，这样可以降低酶的活性，防止细胞自溶。
所采用的固定剂以及取材器械要预先在冰箱(5℃）中存放一段时间。
(4)．准：就是取材部位要准确，这就要求取材者对所取的组织解剖部位要熟悉，必须取到与实验要求相关的部位，不同实验组别间要取相同部位，如需要定向包埋的标本，则要作好定向取材工作。
此外，还要求操作动作轻柔，熟练，尽量避免牵拉、挫伤与挤压对组织造成的人为损伤。
二、什么是瑞利准则？电镜与光镜在原理上有何相似和不同之处？答：1、光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。
当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分辩。
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扫描隧道显微技术(STM)
原子力显微技术(AFM)
激光扫描共焦显微技术
通过微悬臂上的针尖在样 品表面扫描，使针尖与凹 凸不平的样品表面的顶端 原子相互摩擦产生原子力。 在扫描过程中，微悬臂的 上下起伏与等位面的样品 形貌相互对应，所以可通 过针尖与微悬臂之间的隧 道电流变化，得到样品表 面形貌信息。 其分辨率可与透射电镜相 比拟。 AFM不但能通过探测原子 间作用力观察绝缘体，还 可在生物环境中直接观察 生物样品表面结构。
第二章 电子显微镜应用简介
电子显微镜通常分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种 类型。利用电子显微镜可对样品内部结构及样品表面形貌进行超 微结构的观察与研究。
透射电子显微镜：简称透射电镜（TEM)，是一种现代综合性大型分析仪 器，在现代科学技术的研究、开发工作中被广泛地使用。它是一种电子
束透过样品而直接成像的电镜。使用短波长的入射电子束与样品作用后
三、电子显微镜的发展
分辨率进一步提高，点分辨率优于0.3nm，晶格分辨率0.1-0.2nm 放大倍数从十几倍提高到几十万甚至百万倍 种类不断增加，功能不断扩展。（TEM、SEM、STEM、分析电子显微镜、 高压透射电子显微镜、低温透射电子显微镜等） 计算机技术开始用于电子显微镜
第二节 电子显微镜技术的发展与应用
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
表1-1 显微镜发展简史 年代 制造者
荷兰眼镜制造商Janssen 英国科学家和发明家罗伯特.胡克 荷兰业余科学家列文.虎克
显微镜
发明了放大20-30倍的复式光学显微镜
自制复式显微镜。观察软木薄片，第一 次描述植物细胞结构
利用小型高倍透镜制成简单显微镜，放大倍数 达 300 倍，观察动植物活细胞与原生动物，第 一次看到许多单细胞生物。
中国科学院长春光学精密机械与物理 研制成功第一台透射电子显微镜 研究所 研制成功第一台扫描电子显微镜 中国科学院北京科学仪器厂
瑞 士 科 学 家 Binnig 、 Rohrer 、 发明扫描隧道显微镜 Gerber和Weible
中国科学院白春礼
主持研制成功首台原子力显微镜
电子显微镜之父 E.Ruska
测试中心电镜设备介绍
仪器名称：透射电子显微镜
生产厂家：荷兰Philips公司 仪器型号：CM100 主要附件： Gatan 794 性能指标： 点分辨率： 0.34nm CCD
最高加速电压： 100KV 最大放大倍数：45万倍
超高压透射电镜 JEM-ARM1250 分辨率 0.1nm
电镜两大应用领域：
一、材料科学: 高分辨率、高性能、成份和结构分析
（物理、化学、化工、冶金、材料、半导体、地质、矿产、 石油、纺织、轻工、考古、航天、外贸……）
二、生命科学: 中等分辨率、保真性、生化物质定、
水产、环保、食品……）
各种生物体的大小尺度
显微镜可观察到组织水平 分辨率局限于200nm
分辨率：
1.0nm
最高加速电压： 30KV 放大倍数： 20x - 800,000 x
测试中心电镜设备介绍
仪器名称：场发射枪透射电子显微镜 制造厂家：美国ＦＥＩ公司
仪器型号： Tecnai F30 S-TWIN 分 辨 率: 点分辨率 0.20 nm
线分辨率 0.10 nm 信息分辨率0.14nm
激光共聚焦显微镜观察活细胞内生化物质荧光定位
更小的亚细胞结构和病毒等微生物必须用电镜观察！
透射电镜观察研究的各种细胞器
内质网（Porter, Claude, Fullan, 1945） 叶绿体（Porter, Granick, 1947） 高尔基体（Dalton, Felix Sjostrand, 1950）
实用电子显微镜技术
测试中心 陈义芳
第一章 绪论 电子显微镜技术发展简史
第一节 电子显微镜发展简史 第二节 电子显微镜技术的发展与应用 第三节 其他显微技术的发展
第一节 电子显微镜发展简史
电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透 镜代替光束和光学透镜，使物质的超微结构在非常高的放 大倍数下成像的仪器。 电子显微镜
测试中心电镜设备介绍
仪器名称：透射电子显微镜
生产厂家：荷兰Philips公司 仪器型号：Tecnai 12 主要附件： Gatan 792 性能指标： 点分辨率： 线分辨率： 0.24nm 0.14nm CCD
最高加速电压： 120KV 最大放大倍数：65万倍
测试中心电镜设备介绍
仪器名称：场发射扫描电子显微镜 生产厂家：日本 Hitachi 仪器型号： S-4800 主要附件： EDX 背散射电子检测器
表面立体构像。
扫描电镜一种新型的电子光学仪器。它具有制样简单、放大倍数 可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。数十年来，扫描
电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促
进了各有关学科的发展。
扫描电镜可对样品进行综合分析，已成为重要分析工具，广泛应
用于现代科学领域及工农业生产部门。可检查粮食、羊毛纤维、
HR STEM分辨率0.17nm
EDX分辨率136eV 附 件： EAGLE CCD相机 Gatan 626 冷冻传输杆。
三维重构
本电镜适用于对纳米材料，金属材料 及金属基复合材料，陶瓷材料，高分 子材料等的原子尺度结构和成分的研 究．
EDXA 能谱一台 最高加速电压：300KV 放大倍数:TEM 模式 60X—1000KX HAADF STEM模式 200X—100M
分化、增殖与调控等生命活动的规律。在农林科学方面，电镜 技术对植物各种疾病病因诊断与防治的研究越来越重要。利用
电镜技术观察高分子、表面活性剂、碳纳米管及纳米粒子等结
构形态，为化学及材料科学研究提供了有力的技术手段。
第三节 其他显微技术的发展
扫描隧道显微技术(STM) 原子力显微技术(AFM)
一、电子显微镜技术的发展
第一台电子显微镜问世后，面临的首要问题是如何将电子
显微镜技术应用于生物学及其他学科研究。 电子显微镜结构的改进和功能的改善，样品制备技术的改 进，使电子显微镜技术在生命科学研究中发挥了重要作用。
表1-2 电子显微镜技术发展简史
年代 1934 1946 1947 1949 1950 1952 1956 1953 Latta和Hartmann Palade Palade和Siekevitz Porter和Blum Moran 研究者 Marotn Williams和Wyckoff Claude 电子显微镜技术 发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图 将金属投影用于增加电镜图象反差 开始使用铀固定剂 甲基丙烯酸酯被用作包埋介质 用玻璃刀进行组织切片 将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液 用电子显微镜分析细胞碎片 介绍切片机和切片技术 使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术 以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构 高锰酸钾作为固定剂 环氧树脂作为包埋介质 介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色 采用冷冻置换技术制备生物样品 介绍Epon包埋介质 开始研究冷冻断裂技术 用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究 对蛋白质吸附于胶体金进行探讨 将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜 胶体金颗粒作为一种示踪物用于电子显微技术研究 胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜 首次制备蛋白质A-金复合物 建立了制备免疫球蛋白-金颗粒基本方法 提出包埋后免疫金标记技术
样品(样品厚度为50~70 nm左右)；样品制备以超薄切片为主，操作比较
复杂。
透射电镜适用于样品内部显微结构及样品外形(状)的观察，也可进行纳米
样品粒径大小的测定。
扫描电子显微镜：简称扫描电镜(SEM)，是用极细的电子束在样
品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信 号运送到显像管，在显示屏上显示物体形貌。如细胞、组织等的
1590 1665
1665 1931 1938 1939 1965 1959 1975 1981 1990
德国物理学家Knoll和Ruska
研制成功第一台透射电子显微镜 研制成功第一台扫描电子显微镜
Ardenne
德国Siemens公司
英国剑桥科学仪器有限公司
生产了第一台商品用的透射电子显微镜 扫描电子显微镜作为商品问世
纸张、钢铁质量等，观察矿石结构、检测催化剂微观结构、观察 正常细胞与癌细胞差异等。
测试中心电镜设备介绍
仪器名称：环境扫描电子显微镜 生产厂家：荷兰 Philips 仪器型号： XL-30 ESEM 主要附件：能谱分析仪 背散射电子探头
分辨率：
功
3.4nm
低真空 环境模式
能：具有高真空
最高加速电压： 30KV 最大放大倍数：10万倍
• 扫描隧道显微技术(STM)
• 原子力显微技术(AFM)
• 激光扫描共焦显微技术
利用共焦光路及激光扫 描，在观察较厚样品的 内部结构或直接观察细 胞时，可使所选定的不 同层面每一焦点面影象 清晰，从而得到细胞不 同切面上的一系列图象， 经计算机系统快速分析 处理，即可重组出样品 三维立体图象，展现细 胞瞬间变化的形态结构。
激光扫描共焦显微技术
扫描隧道显微技术(STM)
原子力显微技术(AFM)
激光扫描共焦显微技术
利用量子力学中隧道效 应产生隧道电流信号， 获得反映样品表面原子 形态结构和原子排列图 象。 具有原子尺度的高分辨 率。 可以观察单原子层的实 时结构图象，并能在大 气、真空甚至液体环境 中观察自然状态下的样 品表面结构，因而在半 导体、金属、无机材料 及生物学研究等方面有 广阔的应用前景。
世界上第一台电子显微镜