土壤酸性磷酸酶(Solid-acid phosphatase,S-ACP)活性测定试剂盒
实验十五：酸性磷酸酶的显示
lOOml
• 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其
42ml
• 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共
200ml
• B-甘油磷酸钠
2g
• 醋酸铅
2g
• 5％氯化镁
5ml
• 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过 滤使用。
• 3．材料：小鼠腹腔液涂片
• 【方法步骤】 • 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已
• 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天 一次。 • 2．颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔。 • 3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层，室温 晾干。 • 4．将涂片滴置于温盒中，滴加适量ACP作用液， 37℃作用30分钟。取出后，蒸馏水漂洗。用10% 甲醛钙溶液后固定5min。 • 5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，进行显 色。取出后蒸馏水漂洗，镜检。 • 6．对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠，而以蒸 馏水代替；或入作用液前先用高温（50）处理 30min，使酶失去活性，作好标记，然后同时进 行上述实验。
• β-甘油磷酸钠 甘油+PO3-
• PO4 +Pb（NO3)2
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
土壤酸性磷酸酶(S-ACP)检测
迪信泰检测平台
土壤酸性磷酸酶（S-ACP）检测
土壤酸性磷酸酶（Soil acid phosphatase, S-ACP）是土壤磷酸酶的一种，土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。
通常按照其最适 pH 范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。
酸性环境中，土壤酸性磷酸酶催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可表征土壤酸性磷酸酶的活性。
迪信泰检测平台采用生化法，利用醋酸盐缓冲液-比色法可高效、精准的检测土壤酸性磷酸酶活性变化。
此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定土壤酸性磷酸酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 土壤酸性磷酸酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
根分泌物对土壤中磷活化的影响_聂艳丽
第17卷 第3期 云南农业大学学报 V ol117 N o13 2002年 9月 Journal of Y unnan Agricultural University Sep.2002根分泌物对土壤中磷活化的影响Ξ聂艳丽,郑 毅,林克惠(云南农业大学资源与环境学院,云南昆明650201)摘要:磷元素是植物生长所需的大量营养元素之一,土壤中缺乏磷时会导致作物对缺磷的一系列适应性变化,其中根分泌物的H+,低分子有机酸、酸性磷酸酶对固定在土壤中的磷有活化作用。
关键词:根分泌物;酸化;低分子量有机酸;酸性磷酸酶;磷的活化中图分类号:S15813 文献标识码:A 文章编号:1004-390X(2002)03-0281-061 概述磷是植物必需的大量营养元素之一,不仅是植物体内许多重要化合物的组分,而且还以多种途径参与植物体内的各种代谢过程,它也是农业生产的重要物质保证,又是不可再生的矿质资源。
在人类赖以生存的土壤—植物—动物生态系统中,磷起着其它元素不可替代的作用[1]。
然而,世界上绝大部分农田土壤都严重缺磷,虽然在肥沃的土壤,土壤溶液中有效磷的浓度会超过10μm ol/L,但绝大部分的土壤中,有效磷的浓度在2μm ol/L左右,这比植物组织所需的磷(5～20mm ol/L)少了好几个数量级[2],所以磷是我国乃至世界农业生产中最重要的限制因素之一。
根系是植物吸收土壤养分、水分的最主要器官。
养分进入根系的途径主要为根系的直接截获及通过质流、扩散到达根表后被根系吸收。
研究表明,磷由土壤溶液向根的迁移主要靠扩散作用,而磷在土壤中的扩散系数却很低[约为3×10-14m ol/ (cm・s)],植物根系主要吸收距根表面1～4mm根际土壤中的磷。
所以根系形态,侧根数量、根长度、密度与植物的磷效率密切相关。
植物在长期磷胁迫的情况下,常常通过改变根系形态来提高植物对土壤磷素的吸收能力,主要表现在根冠比、根长度、根毛长度及侧根数量的增加[2,3]。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶1.土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2.Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
（用缓冲液配制）；取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、-1浓度的酚标准溶液梯度。
30min后比色测定。
绘制标准曲0.0018、0.0022和0.0026mg?g线。
5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。
土壤酸性磷酸酶(soil acid phosphatase)活性测定试剂盒(分光光度法)使用说明
土壤酸性磷酸酶（soil acid phosphatase）活性测定试剂盒（分光光度法）使用说明货号:BC0140规格:50T/48S产品简介：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。
酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。
产品内容：试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
用前加50mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体×1瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。
临用前加1152μL无水乙醇（自备），48μL蒸馏水充分溶解。
（变褐色后不能再使用）标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05mL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。
8000rpm，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL蒸馏水，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A空白管。
3.标准管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL标准液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A标准管。
4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL上清液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A测定管。
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在ph4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及ph也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）ph5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（ph=5.0）a：0.2mol/l醋酸溶液（11.5ml，稀释至1000ml）b：0.2mol/l醋酸钠溶液（16.4gc2h3o2na或27.2gc2h3o2na·3h2o 定容至1000ml）14.8mla+35.2mlb混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂。
取0.125g2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1l，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml酚原液稀释至1l（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制。
取1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min 后，加入20ml0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
寒温带多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性动态特征
第５２卷第３期东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报Ｖｏｌ．５２Ｎｏ．３２０２４年３月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＯＲＴＨＥＡＳＴＦＯＲＥＳＴＲＹＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＭａｒ．２０２４１）国家重点研发项目（２０２１ＹＦＤ２２００４０５）㊂第一作者简介：刘巧娟，女，１９９７年１０月生，东北林业大学林学院，硕士研究生㊂Ｅ－ｍａｉｌ：１９１２１０６２１８＠ｑｑ．ｃｏｍ㊂通信作者：满秀玲，东北林业大学林学院，教授㊂Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｎｎｅ⁃ｆｕ＠１６３．ｃｏｍ㊂收稿日期：２０２３年１０月１５日㊂责任编辑：段柯羽㊂寒温带多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性动态特征１）刘巧娟张之松满秀玲㊀高明磊㊀赵佳龙（东北林业大学，哈尔滨，１５００４０）（国家石油天然气管网集团有限公司建设项目管理分公司）（东北林业大学）㊀㊀摘㊀要㊀为探究寒温带白桦（Ｂｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）次生林土壤酶活性随林龄变化的动态特征，分析土壤酶活性与环境因子的关系，选择大兴安岭北部不同林龄（３０㊁４５㊁６６ａ）白桦林为研究对象，测定土壤深度（ｈ）为０＜ｈɤ５ｃｍ㊁５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ㊁１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ㊁２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层土壤碳㊁氮质量分数及磷转化酶（过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁脲酶㊁酸性磷酸酶）活性，并对其动态变化规律及影响因子进行分析㊂结果表明：６ １０月份，３个林龄的白桦林土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁脲酶㊁酸性磷酸酶活性呈单峰曲线变化趋势，变化范围分别为０．８５ ４．１４ｍＬ㊃ｇ－１㊁４．７７ ７０．３４ｍｇ㊃ｇ－１㊁０．９０ １１．１２ｍｇ㊃ｇ－１㊁０．０７ ０．７５ｍｇ㊃ｇ－１㊂林龄对土壤酶活性有显著影响，林龄为３０ａ时，白桦林土壤酶活性较低；林龄为４５ａ时，白桦林土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性相对较高，林龄为６６ａ时，白桦林土壤脲酶活性较高㊂林龄为３０ａ的白桦林土壤过氧化氢酶及酸性磷酸酶活性在各土层均表现为７月份最高，８月份时该林龄表层（０＜ｈɤ５ｃｍ）土壤蔗糖酶活性最高㊂林龄为４５ａ的白桦林各土层过氧化氢酶活性及表层土壤蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性均为９月份最高㊂林龄为６６ａ的白桦林表层土壤过氧化氢酶㊁脲酶㊁酸性磷酸酶活性均为８月份最高，而其他土层在该林龄时这３种酶活性的变化规律差异较大㊂微生物生物量碳是驱动林龄为３０ａ的白桦林土壤酶活性变化的主要因子，土壤含水率及可溶性有机碳对林龄为４５ａ的白桦林土壤酶活性影响较大，林龄为６６ａ的白桦林土壤酶活性主要影响因子则是硝态氮㊂林龄对白桦林土壤酶活性影响显著，过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性随林龄增加呈先增后降的变化趋势，脲酶活性则随林龄增加而增加㊂关键词㊀大兴安岭；次生林；林龄；土壤酶活性；季节动态分类号㊀Ｓ７１４．２ＤｙｎａｍｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳｏｉｌＥｎｚｙｍｅＡｃｔｉｖｉｔｙｉｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＡｇｅＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａＦｏｒｅｓｔｓｉｎＴｈｅＣｏｌｄＴｅｍｐｅｒ⁃ａｔｅＰｅｒｍａｆｒｏｓｔＲｅｇｉｏｎ／／ＬｉｕＱｉａｏｊｕａｎ（ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）；ＺｈａｎｇＺｈｉｓｏｎｇ（ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＰｒｏｊｅｃｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔＢｒａｎｃｈｏｆＮａｔｉｏｎａｌＰｅｔｒｏｌｅｕｍａｎｄＮａｔｕｒａｌＧａｓＰｉｐｅｌｉｎｅＮｅｔｗｏｒｋＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ．）；ＭａｎＸｉｕｌｉｎｇ，ＧａｏＭｉｎｇｌｅｉ，ＺｈａｏＪｉａｌｏｎｇ（ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）／／ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２４，５２（３）：１２５－１３１．ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｆｏｒｅｓｔｓｏｆＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｉｎｔｈｅｃｏｌｄ⁃ｔｅｍｐｅｒａｔｅｚｏｎｅｗｉｔｈｆｏｒｅｓｔａｇｅ，ａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓ，ｄｉｆｆｅｒ⁃ｅｎｔ⁃ａｇｅｄ（３０，４５，６６ｙｅａｒｓ）Ｂ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔｓｉｎｔｈｅｎｏｒｔｈｅｒｎｐａｒｔｏｆｔｈｅＤａｘｉｎｇ ａｎｌｉｎｇＭｏｕｎｔａｉｎｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔｓ．Ｔｈｅｓｏｉｌｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ（ｃａｔａｌａｓｅ，ｓｕｃｒａｓｅ，ｕｒｅ⁃ａｓｅ，ａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）ａｃｔｉｖｉｔｙｍｅａｓｕｒｅｄｉｎｓｏｉｌｌａｙｅｒｓｗｉｔｈｓｏｉｌｄｅｐｔｈｓｏｆ０＜ｈɤ５ｃｍ，５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ，１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ，ａｎｄ２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ．Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｒｏｍＪｕｎｅｔｏＯｃｔｏｂｅｒ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔａｌａｓｅ，ｓｕｃｒａｓｅ，ｕｒｅａｓｅ，ａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｔｈｅｓｏｉｌｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅ⁃ａｇｅｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆｓｉｎｇｌｅ⁃ｐｅａｋｃｕｒｖｅｓ，ｗｉｔｈｒａｎｇｅｓｏｆ０．８５－４．１４ｍＬ㊃ｇ－１，４．７７－７０．３４ｍｇ㊃ｇ－１，０．９０－１１．１２ｍｇ㊃ｇ－１，ａｎｄ０．０７－０．７５ｍｇ㊃ｇ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｏｒｅｓｔａｇｅｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｍｐａｃｔｏｎｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｈｅ３０⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ，ｔｈｅｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｌｏｗ．Ｉｎｔｈｅ４５⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄｆｏｒｅｓｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔ⁃ａｌａｓｅ，ｓｕｃｒａｓｅ，ａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｔｈｅｓｏｉｌｗｅｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈ．Ｉｎｔｈｅ６６⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄｆｏｒｅｓｔ，ｓｏｉｌｕｒｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｈｉｇｈｅｒ．Ｉｎｔｈｅ３０⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔａｌａｓｅａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｔｈｅｓｏｉｌｗｅｒｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎＪｕｌｙ，ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｕｃｒａｓｅｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｓｏｉｌ（０＜ｈɤ５ｃｍ）ｗａｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎＡｕｇｕｓｔ．Ｉｎｔｈｅ４５⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔａｌａｓｅｉｎａｌｌｓｏｉｌｌａｙｅｒｓａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｕｃｒａｓｅａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｓｏｉｌｗｅｒｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎＳｅｐｔｅｍｂｅｒ．Ｉｎｔｈｅ６６⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔａｌａｓｅ，ｕｒｅａｓｅ，ａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｓｏｉｌｗｅｒｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎＡｕｇｕｓｔ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｏｔｈｅｒｓｏｉｌｌａｙｅｒｓｖａｒｉｅｄｇｒｅａｔｌｙｉｎｔｈｉｓｆｏｒｅｓｔａｇｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｉｏｍａｓｓｃａｒｂｏｎｗａｓｔｈｅｍａｉｎｆａｃｔｏｒｄｒｉｖｉｎｇｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅ３０⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ，ｗｈｉｌｅｓｏｉｌｍｏｉｓｔｕｒｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｈａｄａｇｒｅａｔｅｒｉｍｐａｃｔｏｎｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉ⁃ｔｙｉｎｔｈｅ４５⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ．Ｎｉｔｒａｔｅｎｉｔｒｏｇｅｎｗａｓｔｈｅｍａｉｎｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｆｏｒｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅ６６⁃ｙｅａｒ⁃ｏｌｄＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔ．ＦｏｒｅｓｔａｇｅｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｍｐａｃｔｏｎｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ，ｗｉｔｈｃａｔａ⁃ｌａｓｅ，ｓｕｃｒａｓｅ，ａｎｄａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｓｈｏｗｉｎｇａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｒｅｎｄｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｄｅｃｒｅａｓｅｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｆｏｒｅｓｔａｇｅ，ｗｈｉｌｅｕｒｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｆｏｒｅｓｔａｇｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｄａｘｉｎｇ ａｎｌｉｎｇＭｏｕｎｔａｉｎｓ；Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｆｏｒｅｓｔ；Ｓｔａｎｄａｇｅ；Ｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｓｅａｓｏｎａｌｄｙｎａｍｉｃｓ㊀㊀土壤酶在森林生态系统的碳㊁氮㊁磷等物质循环过程中起关键作用，其活性受生物因素（植物㊁土壤微生物）和非生物因素（土壤温度㊁土壤ｐＨ㊁有效养分等）的综合影响［１－４］㊂土壤酶不仅能参与土壤生物化学反应过程，还能促进土壤有机质分解和腐殖㊂土壤酶活性对土壤养分环境变化较敏感，能表征土壤碳㊁氮㊁磷质量分数的高低及微生物对土壤养分的吸收利用状况，因此，土壤酶活性是衡量森林生态系统功能的重要生化指标［１，４－５］㊂已有研究表明，林龄是影响森林生态系统土壤酶活性的主要因素［１－２］㊂林龄不仅会改变林分结构㊁林内小气候㊁动植物分泌物及土壤理化性质等，还会造成土壤微生物种类㊁数量㊁组成不同，进而导致土壤酶活性发生变化［２，６］㊂目前，很多学者对森林土壤酶活性进行了研究，例如，有研究表明，随林龄的增长，桉树人工林土壤酶活性呈增加趋势［７］，油松林土壤酶活性则呈先增加后降低的趋势［８］，华北落叶松林土壤酶活性呈先增加后降低再增加的变化趋势［９］；也有研究发现，随林龄的增加，光皮桦林土壤过氧化氢酶㊁脲酶㊁酸性磷酸酶等酶活性呈先降低后增加的趋势［１０］㊂总之，林龄对土壤酶活性有重要影响，但局限于树种㊁立地条件㊁林分起源㊁气候带等差异，因而产生的影响不同㊂随着林龄增加，土壤酶活性出现不同的变化情况，这一定程度上是由于土壤微生物的生境状况不同导致的［２，６］㊂过往研究往往关注亚热带［７］㊁暖温带［９］等地区林龄对土壤酶活性的影响，缺乏生境寒冷的寒温带地区林龄对土壤酶活性影响的研究㊂因此，本研究旨在明确寒温带地区森林林龄对土壤酶活性的影响，揭示随林龄增长土壤酶活性的变化特征，加深对土壤碳㊁氮㊁磷等物质循环的认识㊂大兴安岭北部是我国唯一的高纬度寒温带针叶林区，作为我国东北平原重要的生态屏障，大兴安岭森林生态系统发挥着重要的作用［１１］㊂由于森林火灾和采伐等原因，大兴安岭地区形成了大面积的白桦（Ｂｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）次生林，占本地区森林总面积的４１．１５％，占总蓄积量的４１．５９％，白桦林在该地区占有重要的生态地位［１２－１４］㊂近年来，有大量关于该区域白桦次生林碳氮储量［１４］㊁土壤碳排放［１１，１４］及凋落物分解归还［１５］等的研究，而关于直接影响森林土壤一系列生命活动的土壤酶活性的研究较少㊂因此，本研究采用空间代替时间的方法，选择大兴安岭北部林龄为３０㊁４５㊁６６ａ的白桦林为研究对象，探讨不同林龄白桦林土壤酶活性的变化规律，分析土壤酶活性与环境因子之间的相关性，旨在探究白桦次生林随林龄增加时其土壤酶活性的变化规律，以期为我国寒温带白桦林养分循环机制研究提供参考㊂１㊀研究区概况研究区位于大兴安岭地区漠河县黑龙江漠河森林生态系统国家定位观测研究站，地理坐标为１２２ʎ６ᶄ １２２ʎ２７ᶄＥ㊁５３ʎ１７ᶄ ５３ʎ３０ᶄＮ㊂该地区属寒温带大陆性季风气候，年平均气温为－４．９ħ，年平均降水量为４００ｍｍ左右，无霜期８０ ９０ｄ，地带性土壤类型为棕色针叶林土㊂该地区顶级群落为明亮针叶林，即兴安落叶松（Ｌａｒｉｘｇｍｅｌｉｎｉｉ）林，另外还有樟子松（Ｐｉｎｕｓｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）林㊁白桦林和山杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｄａｖｉｄｉａｎａ）林等森林类型㊂林下灌木主要包括兴安杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｄａｕｒｉｃｕｍ）㊁杜香（Ｌｅ⁃ｄｕｍｐａｌｕｓｔｒｅ）㊁笃斯越橘（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ）等㊂２㊀研究方法２．１㊀样地设置与土样采集于２０２２年５月在前期踏查基础上，选取不同时期火烧之后形成的３０㊁４５㊁６６ａ白桦次生林为研究对象，在每一林型内选择没有干扰处于自然状态的典型地段设置３个２０ｍˑ３０ｍ的标准样地，进行每木检尺，记录基本信息（表１）㊂６ １０月在每个标准样地内以 Ｓ 形设置５个采样点，采集土壤深度（ｈ）为０＜ｈɤ５ｃｍ㊁５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ㊁１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ㊁２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层土样约１ｋｇ，去除土壤中的石块和动植物残体等杂物后，低温冷藏运回实验室㊂将土样分成２份，一份用自封袋密封于冰箱４ħ储存，用于测定微生物生物量碳氮㊁可溶性有机碳氮㊁铵态氮㊁硝态氮等指标；另一份风干后研磨，过筛，密封保存，用于测定土壤有机碳质量分数㊁土壤全氮质量分数㊁全磷质量分数㊁速效磷质量分数㊁酶活性㊁土壤ｐＨ等指标㊂表１㊀不同林龄白桦林样地基本情况林龄／ａ平均树高／ｍ平均胸径／ｃｍ坡向坡位坡度／（ʎ）郁闭度林分密度／株㊃ｈｍ－２有机碳质量分数／ｇ㊃ｋｇ－１全氮质量分数／ｇ㊃ｋｇ－１全磷质量分数／ｇ㊃ｋｇ－１土壤密度／ｇ㊃ｃｍ－３林下主要植物３０８．８９ʃ２．０４７．０５ʃ１．９４东北坡中３０．７２０１７ʃ２５０２１．８１ʃ０．５５０．９５ʃ０．０５０．４１ʃ０．０３１．３５ʃ０．２３越橘，笃斯越橘，杜香，小叶章４５１２．８４ʃ３．４２１１．２０ʃ３．１６东北坡中２０．９２７３３ʃ２７５５８．１７ʃ０．５６２．３０ʃ０．０４０．５７ʃ０．１２１．１５ʃ０．１２越橘，杜香，小叶章，二叶舞鹤草６６１６．２３ʃ４．７９１４．５１ʃ６．０３东北坡中６０．８１５１７ʃ２００４９．３７ʃ０．６３１．６３ʃ０．１００．５３ʃ０．１３１．２４ʃ０．１７越橘，杜香，兴安杜鹃，红花鹿蹄草㊀㊀注：平均树高㊁平均胸径㊁株数密度㊁有机碳质量分数㊁全氮质量分数㊁全磷质量分数㊁土壤密度数据为 平均值ʃ标准差 ㊂２．２㊀土壤基本理化性质的测定土壤含水量采用烘干法测定；土壤温度使用数字式瞬时温度计（６３１０，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ＵＳＡ）测定；土壤密度采用环刀法测定；土壤ｐＨ使用ＰＨＳ－３Ｅ型ｐＨ计（土水比为１．０ʒ２．５）测定；总有机碳㊁微生物生物量碳氮㊁可溶性有机碳氮质量分数采用Ｖａｒｉｏ－ＴＯＣ测定，全氮㊁铵态氮㊁硝态氮质量分数使用ＡＡ３连续流动分析仪测定，全磷㊁有效磷采用钼锑抗比色法测６２１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷定㊂２．３㊀４种土壤酶活性测定土壤脲酶（ＵＲＥ）活性采用苯酚钠－次氯酸钠比色法测定，用２４ｈ后１ｇ土壤中铵态氮的质量表示［７］；蔗糖酶（ＳＵＣ）活性采用３，５－二硝基水杨酸比色法测定，用２４ｈ后１ｇ土壤中葡萄糖的质量表示［８，１０］；过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性采用高锰酸钾滴定法测定，用震荡２０ｍｉｎ后１ｇ土壤所消耗的体积为０．１ｍｏＬ的ＫＭｎＯ４质量表示［９］；酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活性采用对硝基苯磷酸钠测定，用１ｈ后土壤所释放酚的质量表示［７］㊂２．４㊀数据处理采用Ｅｘｃｅｌ对数据进行处理，用ＳＰＳＳ２６．０软件对数据进行统计分析㊂采用单因素方差法（Ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）和最小显著性差异法（ＬＳＤ）检验不同林龄天然次生白桦林４种土壤酶活性的差异显著性（α＝０．０５）；用Ｃａｎｏｃｏ５．０软件对土壤酶活性和相关因子进行冗余分析（ＲＤＡ），探究影响土壤酶活性变化的主导因素㊂３㊀结果与分析３．１㊀不同样地土壤酶活性差异由表２可知，不同林龄白桦林土壤过氧化氢酶活性由大到小依次为４５㊁６６㊁３０ａ，且林龄为４５ａ的白桦林过氧化氢酶活性显著高于林龄为３０ａ的（Ｐ＜０．０５）㊂３个林龄白桦林土壤蔗糖酶活性随林龄增加呈先升后降的变化趋势，即林龄为４５ａ时最大，６６ａ次之，３０ａ时最小，且林龄为４５ａ的白桦林蔗糖酶活性显著高于其他２个林龄㊂随土层深度增加，蔗糖酶活性显著降低（Ｐ＜０．０５）㊂土壤脲酶活性随林龄增长呈增加趋势，即林龄为６６ａ时最大，４５ａ时次之，３０ａ时最小㊂不同林龄白桦林土壤酸性磷酸酶活性由大到小依次为４５㊁６６㊁３０ａ，且林龄为３０ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性均显著低于其他２个林龄㊂表２㊀各林龄不同土层的土壤酶活性林龄／ａ土壤深度（ｈ）／ｃｍ过氧化氢酶活性／ｍＬ㊃ｇ－１蔗糖酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１脲酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１酸性磷酸酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１３００＜ｈɤ５（３．０６ʃ０．０８）ａ㊀（４７．５４ʃ０．９２）ａ（３．５５ʃ０．３５）ａ（０．３７ʃ０．０３）ａ５＜ｈɤ１０（２．８１ʃ０．０５）ａｂ（４２．５７ʃ２．５２）ａｂ（２．７８ʃ０．２４）ｂ（０．２５ʃ０．０１）ｂ１０＜ｈɤ２０（２．０８ʃ０．１２）ｂｃ（２８．９１ʃ１．９５）ｂ（２．０８ʃ０．３３）ｂｃ（０．２０ʃ０．０１）ｂｃ２０＜ｈɤ３０（１．４２ʃ０．２０）ｃ（１２．４０ʃ３．１７）ｃ（１．６０ʃ０．１６）ｃ（０．１５ʃ０．０１）ｃ４５０＜ｈɤ５（３．５９ʃ０．０５）ａ（６０．００ʃ２．０３）ａ（７．００ʃ０．４０）ａ（０．５６ʃ０．０４）ａ５＜ｈɤ１０（２．９９ʃ０．１８）ａｂ（５１．４５ʃ２．２４）ａ（４．３６ʃ０．４７）ｂ（０．３８ʃ０．０１）ｂ１０＜ｈɤ２０（２．４５ʃ０．２０）ｂｃ（３５．４３ʃ０．７８）ｂ（２．５４ʃ０．４４）ｃ（０．２４ʃ０．０１）ｃ２０＜ｈɤ３０（２．０６ʃ０．０７）ｃ（２０．５０ʃ０．４５）ｃ（１．５５ʃ０．２５）ｄ（０．１８ʃ０．０１）ｄ６６０＜ｈɤ５（３．４１ʃ０．１９）ａ（５５．１６ʃ１．７５）ａ（７．７９ʃ０．５１）ａ（０．４９ʃ０．０２）ａ５＜ｈɤ１０（３．００ʃ０．０６）ａｂ（４５．３８ʃ２．５８）ａ（４．０３ʃ０．０９）ｂ（０．３２ʃ０．０２）ｂ１０＜ｈɤ２０（２．４４ʃ０．０２）ｂ（２８．５０ʃ２．０２）ｂ（３．４１ʃ０．５１）ｃ（０．１９ʃ０．０２）ｃ２０＜ｈɤ３０（１．６１ʃ０．０７）ｃ（１３．２３ʃ０．５３）ｃ（１．７７ʃ０．２３）ｄ（０．１６ʃ０．０１）ｄ㊀㊀注：表中数据为 平均值ʃ标准差 ，数据后同列不同小写字母表示相同林龄不同土壤深度间差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂３．１．１㊀土壤过氧化氢酶活性动态变化由表３可知，６ １０月不同林龄白桦林土壤过氧化氢酶活性均表现为随土层加深而逐渐降低，各月份间过氧化氢酶活性变化差异较大㊂林龄为３０ａ的白桦林０＜ｈɤ３０ｃｍ土层过氧化氢酶活性均呈先增加后降低的趋势，且在７月份时最高；林龄为４５㊁６６ａ的白桦林土壤过氧化氢酶活性则呈先降再升的趋势，且７月份最低，１０月份相对较高㊂对于０＜ｈɤ５ｃｍ土层土壤过氧化氢酶活性，林龄为３０ａ的白桦林７ ９月份差异不显著；林龄为４５ａ的白桦林在９㊁１０月份时差异不显著，但与其他月份相比差异显著；林龄为６６ａ的白桦林除７月份外，其他月份土壤过氧化氢酶活性差异均不显著㊂５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ及１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ土层土壤过氧化氢酶活性变化规律相似，均表现为７月份时林龄为３０ａ的白桦林土壤过氧化氢酶活性显著高于其他２个林龄㊂对于２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层，１０月份林龄为４５ａ的白桦林土壤过氧化氢酶活性显著高于其他２个林龄㊂３．１．２㊀土壤蔗糖酶活性的动态变化由表３可知，林龄为３０ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性表现为７㊁８月份最高，林龄为４５㊁６６ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性均在９月份最高，且显著高于其他月份（Ｐ＜０．０５）㊂对于０＜ｈɤ５ｃｍ土层，林龄为３０ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性最大值与最小值分别出现在８㊁６月份，林龄为４５㊁６６ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性均在９月份出现最大值，最小值分别出现于７㊁６月份㊂对于５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ土层，林龄为３０ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性在７月份出现最大值，６月份出现最小值；林龄为４５㊁６６ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性最大值均出现在９月份，最小值则分别在７㊁６月份出现㊂对于１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ土层，林龄为３０ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性变幅大于其他２个林龄，７２１第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘巧娟，等：寒温带多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性动态特征为２０．９１ ３９．９４ｍｇ㊃ｇ－１㊂对于２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层，与林龄为４５㊁６６ａ的白桦林相比，林龄为３０ａ的白桦林土壤蔗糖酶活性在６ １０月份变幅较小㊂３个林龄白桦林土壤蔗糖酶活性均随土层深度增加呈显著降低趋势（Ｐ＜０．０５）㊂表３㊀各林龄不同土层及月份的土壤酶活性林龄／ａ土壤深度（ｈ）／ｃｍ过氧化氢酶活性／ｍＬ㊃ｇ－１６月份７月份８月份９月份１０月份蔗糖酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１６月份７月份８月份９月份１０月份３００＜ｈɤ５（２．７２ʃ０．２５）Ｂａ（３．５８ʃ０．１０）Ａａ（３．３７ʃ０．０５）Ａａ（３．０５ʃ０．１５）Ａａ（２．６０ʃ０．０３）Ｂａ（３６．４０ʃ１．８３）Ｄａ（５９．２８ʃ０．４９）Ａａ（６０．５４ʃ０．２５）Ａａ（３８．７９ʃ０．６９）Ｃａ（４２．７１ʃ１．３３）Ｂａ５＜ｈɤ１０（２．５８ʃ０．２０）Ｂａ（３．４１ʃ０．０８）Ａａ（３．１５ʃ０．１５）Ａａ（２．４５ʃ０．２０）Ｂｂ（２．４５ʃ０．１０）Ｂａ（３０．２９ʃ４．９１）Ｂａ（５８．７１ʃ１．０９）Ａａ（５７．８９ʃ２．５６）Ａａ（３１．８８ʃ１．８４）Ｂｂ（３４．０９ʃ２．１８）Ｂｂ１０＜ｈɤ２０（１．４０ʃ０．２８）Ｃｂ（３．１１ʃ０．３８）Ａａ（２．２７ʃ０．０５）Ｂｂ（２．３０ʃ０．０８）Ｂｂ（１．３０ʃ０．１５）Ｃｂ（２１．２１ʃ４．３８）Ｃｂ（３６．３２ʃ０．６６）Ａｂ（３９．９４ʃ１．７９）Ａｂ（２６．１８ʃ０．９３）Ｂｃ（２０．９１ʃ２．０１）Ｃｃ２０＜ｈɤ３０（０．８５ʃ０．４８）Ｂｂ（２．０７ʃ０．４８）Ａｂ（２．１０ʃ０．２３）Ａｂ（１．１０ʃ０．０３）Ｂｃ（０．９９ʃ０．０６）Ｂｃ（１５．１２ʃ２．２０）Ａｂ（１３．３８ʃ６．１０）Ｂｃ（１４．０５ʃ２．１８）Ａｃ（１２．３９ʃ２．８５）Ｂｄ（７．０６ʃ２．５３）Ｃｄ４５０＜ｈɤ５（３．７１ʃ０．１０）Ｂａ（２．８９ʃ０．１４）Ｄａ（３．１５ʃ０．０８）Ｃａ（４．１４ʃ０．０３）Ａａ（４．０７ʃ０．１７）Ａａ（５６．５４ʃ２．１０）Ｃａ（４６．６３ʃ３．８２）Ｄａ（６５．２７ʃ０．７５）Ｂａ（７０．３４ʃ２．５１）Ａａ（６１．２４ʃ０．９７）Ｂａ５＜ｈɤ１０（３．１０ʃ０．１２）ＡＢｂ（２．１４ʃ０．２４）Ｃｂ（２．６７ʃ０．５１）Ｂａｂ（３．６７ʃ０．５１）Ａａ（３．３７ʃ０．０９）Ａｂ（４８．５３ʃ４．０５）Ｃｂ（３２．２４ʃ３．９８）Ｄｂ（５３．３８ʃ０．８６）ＢＣｂ（６８．１８ʃ１．５５）Ａａ（５４．９２ʃ０．７８）Ｂｂ１０＜ｈɤ２０（２．３０ʃ０．５３）Ｂｃ（１．５７ʃ０．０９）Ｃｃ（２．３２ʃ０．０５）Ｂｂｃ（２．７５ʃ０．５０）ＡＢｂ（３．３０ʃ０．２０）Ａｂ（３４．０１ʃ０．１９）Ｃｃ（２３．７１ʃ１．１１）Ｄｃ（３７．６５ʃ０．２２）Ｂｃ（４２．８１ʃ２．０５）Ａｂ（３９．００ʃ０．３４）Ｂｃ２０＜ｈɤ３０（１．９３ʃ０．２５）Ｂｃ（１．１９ʃ０．１６）Ｃｄ（１．９２ʃ０．０９）Ｂｃ（２．１４ʃ０．２８）Ｂｂ（３．１０ʃ０．２５）Ａｂ（１５．３３ʃ０．６０）Ｂｄ（９．６８ʃ０．２８）Ｃｄ（２９．０２ʃ０．８７）Ａｄ（２９．２４ʃ０．１４）Ａｃ（１９．２３ʃ０．３８）Ａｄ６６０＜ｈɤ５（３．４８ʃ０．１８）Ａａ（２．４４ʃ０．４２）Ｂａ（３．９４ʃ０．０６）Ａａ（３．４０ʃ０．５３）Ａａ（３．７７ʃ０．０５）Ａａ（４５．１２ʃ４．２０）Ｃａ（６０．３０ʃ１．３４）Ｂａ（６０．７６ʃ０．２９）Ｂａ（６６．９７ʃ０．８５）Ａａ（４２．６７ʃ２．０７）Ｂａ５＜ｈɤ１０（３．４０ʃ０．０８）Ａａ（２．３０ʃ０．１２）Ｃａ（３．３２ʃ０．２０）Ａｂ（２．６２ʃ０．１８）Ｂｂ（３．３５ʃ０．２３）Ａｂ（３６．４２ʃ２．２０）Ｃｂ（５８．２４ʃ０．３９）Ａｂ（４１．６３ʃ０．３２）Ｃｂ（５１．４２ʃ６．２８）Ｂｂ（３９．１７ʃ３．６９）Ａａ１０＜ｈɤ２０（３．００ʃ０．０８）Ａｂ（１．８５ʃ０．０８）Ｃｂ（２．６７ʃ０．１３）Ｂｃ（１．９０ʃ０．０８）Ｃｃ（２．７５ʃ０．０８）Ｂｃ（２３．９７ʃ３．１４）Ｃｃ（４５．９１ʃ１．３０）Ａｃ（２５．２８ʃ０．９０）Ｃｃ（３１．０２ʃ２．２３）Ｂｃ（１６．３０ʃ２．５５）Ｂｂ２０＜ｈɤ３０（２．４０ʃ０．０８）Ａｃ（１．３２ʃ０．１５）Ｃｃ（１．７９ʃ０．２１）Ｂｄ（１．２７ʃ０．０９）Ｃｄ（１．２５ʃ０．２８）Ｃｄ（５．２２ʃ０．２５）Ｄｄ（２７．７０ʃ０．５２）Ａｄ（１５．３９ʃ０．３３）Ｂｄ（４．７７ʃ０．９７）Ｄｄ（１３．０７ʃ０．５７）Ｃｃ林龄／ａ土壤深度（ｈ）／ｃｍ脲酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１６月份７月份８月份９月份１０月份酸性磷酸酶活性／ｍｇ㊃ｇ－１６月份７月份８月份９月份１０月份３００＜ｈɤ５（３．２２ʃ０．１３）ＢＣａ（４．５４ʃ０．３３）Ａａ（４．３０ʃ０．５５）ＡＢａ（２．９８ʃ０．４９）Ｃａ（２．７０ʃ０．２６）Ｃａ（０．２８ʃ０．０１）Ｃａ（０．７３ʃ０．０５）Ａａ（０．４５ʃ０．０５）Ｂａ（０．２３ʃ０．０１）ＣＤａ（０．１８ʃ０．０１）Ｄａ５＜ｈɤ１０（２．８４ʃ０．２８）Ｂａ（３．８７ʃ０．４４）Ａｂ（２．５４ʃ０．２１）Ｂｂ（２．３９ʃ０．２５）Ｂｂ（２．２９ʃ０．０４）Ｂｂ（０．２１ʃ０．０３）Ｃｂ（０．４１ʃ０．０１）Ａｂ（０．３７ʃ０．０１）Ｂｂ（０．１５ʃ０．０１）Ｄｂ（０．１０ʃ０．０１）Ｅｂ１０＜ｈɤ２０（２．２５ʃ０．１３）ＡＢｂ（３．５１ʃ０．３８）Ａｂ（１．８６ʃ０．２９）Ｂｂｃ（１．３２ʃ０．１８）Ｃｃ（１．４５ʃ０．１１）Ｃｂ（０．１９ʃ０．０２）Ｃｂ（０．４０ʃ０．０１）Ａｂ（０．２３ʃ０．０１）Ｂｃ（０．１０ʃ０．０１）Ｄｃ（０．０７ʃ０．０１）Ｅｃ２０＜ｈɤ３０（１．８７ʃ０．１７）Ｂｃ（２．８２ʃ０．２７）Ａｃ（１．１２ʃ０．０６）Ｃｃ（０．９９ʃ０．１４）Ｃｃ（１．２１ʃ０．１５）Ｃｂ（０．１０ʃ０．０１）Ｃｃ（０．３４ʃ０．０２）Ａｃ（０．１９ʃ０．０２）Ｂｄ（０．０８ʃ０．０１）Ｃｄ（０．０７ʃ０．０１）Ｃｄ４５０＜ｈɤ５（６．７６ʃ０．０６）ＢＣａ（５．５８ʃ１．０１）Ｃａ（１１．１２ʃ０．４０）Ａａ（８．０１ʃ０．３８）Ｂａ（３．５１ʃ０．１３）Ｄａ（０．５５ʃ０）Ｂａ（０．３９ʃ０．０４）Ｃａ（０．７５ʃ０．０２）Ａａ（０．７７ʃ０．０３）Ａａ（０．３５ʃ０．０２）Ｃａ５＜ｈɤ１０（４．０３ʃ０．２３）ＢＣｂ（４．０９ʃ０．６０）ＢＣｂ（５．６８ʃ０．２１）Ａｂ（４．６５ʃ０．７４）Ｂｂ（３．３４ʃ０．５６）Ｃａ（０．３４ʃ０．０１）Ｃｂ（０．３３ʃ０．０１）Ｃａ（０．４１ʃ０．０３）Ｂｂ（０．５２ʃ０．０２）Ａｂ（０．３１ʃ０．０１）Ｄｂ１０＜ｈɤ２０（２．７４ʃ０．４７）Ｂｃ（１．４８ʃ０．８１）Ｃｃ（３．６７ʃ０．１７）Ａｃ（３．０５ʃ０．６０）ＡＢｃ（１．７３ʃ０．１７）Ｃｂ（０．２１ʃ０）Ｃｃ（０．１６ʃ０．０１）Ｄｂ（０．２９ʃ０）Ｂｃ（０．３５ʃ０．０２）Ａｃ（０．１９ʃ０．０１）Ｄｃ２０＜ｈɤ３０（２．４５ʃ０．３７）Ａｃ（０．９０ʃ０．１５）Ｃｃ（１．４４ʃ０．３１）Ｂｄ（１．５１ʃ０．１２）Ｂｄ（１．４４ʃ０．３０）Ｂｂ（０．１８ʃ０．０１）Ｂｄ（０．１２ʃ０．０１）Ｃｂ（０．２６ʃ０．０１）Ａｄ（０．１８ʃ０．０１）Ｂｄ（０．１７ʃ０）Ｂｃ６６０＜ｈɤ５（６．６１ʃ０．７１）Ｃａ（５．８５ʃ０．１３）Ｃａ（９．２３ʃ０．３３）Ｂａ（１０．４９ʃ０．２７）Ａａ（６．７７ʃ１．１０）Ｃａ（０．３５ʃ０．０２）Ｄａ（０．６３ʃ０．０１）Ｂａ（０．６８ʃ０．０２）Ａａ（０．５０ʃ０．０３）Ｃａ（０．３１ʃ０．０２）Ｄａ５＜ｈɤ１０（４．５３ʃ０．０９）Ａｂ（４．３８ʃ０．０４）Ａｂ（４．０７ʃ０．０４）Ｂｂ（４．５０ʃ０．１６）Ａｂ（２．６７ʃ０．１１）Ｃｂ（０．３１ʃ０．０３）Ｂａ（０．５６ʃ０．０２）Ａｂ（０．３２ʃ０．０１）Ｂｂ（０．２３ʃ０．０２）Ｃｂ（０．２０ʃ０．０１）Ｃｂ１０＜ｈɤ２０（４．４９ʃ０．９６）Ａｂ（３．９４ʃ０．６８）Ｂｂ（２．５１ʃ０．２７）Ｃｃ（４．２１ʃ０．４８）Ａｂ（１．９１ʃ０．１８）Ｃｃ（０．２５ʃ０．０１）Ａｂ（０．２６ʃ０．０１）Ａｃ（０．１８ʃ０．０１）Ｂｃ（０．２０ʃ０．０６）Ｂｂ（０．０７ʃ０．０１）Ｃｃ２０＜ｈɤ３０（２．５３ʃ０．５５）Ａｃ（１．６０ʃ０．０４）Ｂｃ（１．６１ʃ０．２７）Ｂｄ（１．５５ʃ０．０８）Ｂｃ（１．５８ʃ０．２２）Ｂｃ（０．２３ʃ０．０２）Ａｃ（０．１６ʃ０．０１）Ｃｄ（０．１９ʃ０．０１）Ｂｄ（０．１３ʃ０．０１）Ｄｃ（０．０８ʃ０．０１）Ｅｄ㊀㊀注：表中数据为 平均值ʃ标准差 ，数据后同列不同小写字母表示相同林龄不同土壤深度间差异显著（Ｐ＜０．０５）；同行不同大写字母表示同一指标相同林龄同一土壤深度不同月份间差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂３．１．３㊀土壤脲酶活性的动态变化由表３可知，在６ １０月份，３个林龄白桦林土壤脲酶活性随土层加深呈下降趋势，且不同月份间酶活性变化趋势不同㊂其中，７㊁８月份林龄为３０ａ的白桦林土壤脲酶活性显著高于其他月份，林龄为６６ａ的白桦林土壤脲酶活性则表现为８㊁９月份高于其他月份，林龄为４５ａ的白桦林土壤脲酶活性只有８月份最高㊂对于０＜ｈɤ５ｃｍ土层，林龄为３０ａ的白桦林土壤脲酶活性在７月份最高，１０月份最低；林龄为４５ａ的白桦林土壤脲酶活性最大值和最小值分别出现在８㊁１０月份；林龄为６６ａ的白桦林土壤脲酶活性在９月份最高，７月份最低，且６㊁７㊁１０月份酶活性差异不显著㊂对于５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ土层，林龄为３０㊁４５ａ的白桦林土壤脲酶活性变化趋势相似，最小值均出现在１０月份，最大值分别出现在７㊁８月份；林龄为６６ａ的白桦林土壤脲酶活性在６ ９月变幅较小㊂对于１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ土层，７月份时林龄为４５ａ的白桦林土壤脲酶活性显著低于其他２个林龄㊂对于２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层，林龄为４５㊁６６ａ的白桦林土壤脲酶活性变化趋势较为一致，均呈波动式降低且变幅较小㊂３．１．４㊀土壤酸性磷酸酶活性的动态变化由表３可知，６ １０月不同林龄白桦林土壤酸性磷酸酶活性变化较为一致，且随土层加深而降低㊂具体表现为：林龄为４５ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性呈先降低后增加再降低的趋势，林龄为３０㊁６６ａ的则呈先增加后降低的趋势㊂从月变化规律来看，林龄为３０㊁４５㊁６６ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性分别在７㊁９㊁８月份最高㊂对于０＜ｈɤ５ｃｍ土层，林龄为３０ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性在７月份最高，且与其他月份差异显著（Ｐ＜０．０５）；在７与１０月份㊁８与９月份时，林龄为４５ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性差异不显著；６㊁１０月份时，林龄为６６ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性差异不显著，但与其８２１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷他月份相比有显著差异㊂对于５ｃｍ＜ｈɤ１０ｃｍ及１０ｃｍ＜ｈɤ２０ｃｍ土层，３个林龄白桦林土壤酸性磷酸酶活性变化趋势相似，其中，７月份时林龄为４５ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性显著低于其他２个林龄㊂对于２０ｃｍ＜ｈɤ３０ｃｍ土层，与其他２个林龄相比，林龄为６６ａ的白桦林土壤酸性磷酸酶活性在观测期内变幅较小㊂３．２㊀各影响因子对土壤酶活性的影响冗余分析表明（图１），３个林龄白桦林土壤酶活性与影响因子之间表现出明显的相关性㊂林龄为３０ａ的白桦林第一排序轴和第二排序轴累计解释了土壤酶活性特征８２．０８％的变异，其中微生物生物量碳（Ｐ＝０．００２）是引起土壤酶活性变化的主导因子，贡献率为５５．６％㊂除土壤ｐＨ外，其他指标均与４种土壤酶活性呈正相关关系㊂林龄为４５ａ的白桦林环境因子解释了土壤酶活性特征８８．９７％的变异，其中对土壤酶活性影响显著的因子是土壤含水率和可溶性有机碳，分别解释了土壤酶活性３４．４％㊁２８．８％的变异㊂土壤ｐＨ㊁可溶性有机碳与４种土壤酶活性呈负相关关系㊂硝态碳是影响林龄为６６ａ白桦林土壤酶活性变化的主导因子，贡献率为５０．１％㊂第一排序轴和第二排序轴共同解释了土壤酶活性特征８１．２４％的变异㊂除土壤ｐＨ㊁土壤温度外，其他影响因子均与４种土壤酶活性呈正相关关系㊂ＣＡＴ为过氧化氢酶；ＳＵＣ为蔗糖酶；ＵＲＥ脲酶；ＡＣＰ为酸性磷酸酶；ＭＢＣ为微生物生物量碳；ＭＢＮ为微生物生物量氮；ＤＯＣ为可溶性有机碳；ＤＯＮ为可溶性有机氮；ＮＨ＋４－Ｎ为铵态氮；ＮＯ３－Ｎ为硝态氮；Ｔｓ为土壤温度；ＷＣ为土壤含水率；ＡＰ为速效磷㊂图１㊀３个林龄白桦林土壤酶活性与影响因子冗余分析结果４㊀结论与讨论研究表明，不同林龄白桦林０ ３０ｃｍ土层土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁脲酶㊁酸性磷酸酶活性均低于亚热带地区［１６］和温带地区［１７］的㊂这是由于本研究区位于纬度较高的寒温带，年积温较低㊁湿度高，不利于微生物活动［１５］，加之该地区土层较薄且多石砾，限制了植物根系生长［１８］，因此与其他气候带的森林生态系统相比，该地区土壤酶活性偏低㊂研究发现，３个林龄白桦林土壤酶活性存在显著差异，土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性随林龄增加呈先增加后降低的趋势，这与李文杰等［１９］㊁郭辉９２１第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘巧娟，等：寒温带多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性动态特征等［２０］研究结果一致，但与宋思宇等［１］㊁罗明霞等［２］㊁余春和等［１０］研究有所不同，这是由于研究的树种㊁立地条件㊁林分起源及气候带不同㊂本研究发现，林龄为３０ａ的白桦林土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性显著低于林龄为４５㊁６６ａ白桦林，这是因为树龄为３０ａ的白桦林处于生长旺盛阶段，植物为满足自身生长，需要从土壤中吸收更多的养分，因此土壤养分质量分数及酶底物有效性呈较低水平［２０］㊂然而，随着林龄增加，白桦林根系发育完全且根产物丰富，加之动植物残体输入量增加，土壤有机质累积增多，为微生物生存和发展提供了充足的碳源㊁氮源等，从而提高了土壤酶活性［８］㊂林龄为６６ａ的白桦林生长减缓，消耗土壤养分含量多于归还量，导致酶底物减少，所以土壤中过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶等３种酶活性较低［２１］㊂３个林龄的白桦林土壤脲酶活性与其他３种酶活性表现不一致㊂本研究中，土壤脲酶活性表现为随林龄增加，酶活性呈增加趋势，这与Ｎ素质量分数随着林龄增加而增加有关［２２］㊂脲酶是土壤中唯一可以水解尿素的酶，且其分解尿素的速度是尿素自然分解速度的１０１４倍［２３］，因此，铵态氮随着林龄增加而增加间接说明了脲酶表现出与其相同的变化趋势㊂不同林龄白桦林土壤酶活性季节动态差异显著，监测期内呈单峰变化趋势㊂在气温较高的７ ９月份，４种土壤酶活性较高，６㊁１０月份时酶活性较低㊂６月，土壤未完全融化，土温较低，土壤中可利用的养分较少，因而酶活性呈较低水平［１７－１８］；７ ９月，气温较高，土壤温度也较高，植物根系生长旺盛，适宜的土壤温湿环境为微生物提供了良好的生存环境，同时，该时期良好的水热条件加快了有机质分解及植物残体腐殖化，增强了土壤酶底物的有效性，从而提高了土壤酶活性［２４］㊂１０月份，气温降低，有研究表明，较低的温度会使土壤酶活性降低甚至钝化失活［２４－２５］，因而该时期土壤酶活性较低㊂土层深度也是影响土壤酶活性的重要因素，随土层深度增加，４种土壤酶活性逐渐降低㊂这是由于土壤表层植物根系密度大，凋落物补给充足，养分含量较高，有利于动植物的生长与繁殖，促进了相关酶的分泌，且深层土壤透气性㊁水热状况与表层相差较大，植物根系生长和土壤微生物活动受到限制，故而土壤深层土壤酶活性较低［９，１６，２４，２６］㊂土壤酶活性受土壤温度㊁湿度㊁土壤ｐＨ㊁养分有效性㊁林龄等多种因素的综合影响［３－４，１６］㊂宋思宇等［１］对西藏林芝云杉人工林及陈佳等［２７］对武夷山人工林的研究表明，土壤酶活性与土壤ｐＨ呈显著负相关；孙永磊等［２８］对喀斯特断陷盆地典型林地的研究发现，土壤酶活性与土壤ｐＨ呈显著正相关㊂本研究发现，３个林龄白桦林４种土壤酶活性均与土壤ｐＨ呈显著负相关㊂随林龄的增加，土壤温度㊁湿度及土壤ｐＨ等环境因子发生变化，影响土壤碳㊁氮㊁磷等物质循环速率，导致土壤微生物的数量㊁组成和功能发生改变，从而调控不同种类酶的分泌［３，２９］㊂冗余分析表明，影响林龄为３０ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子是微生物生物量碳，其贡献率高达５５．６％㊂影响林龄为４５ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子是土壤含水率和可溶性有机碳，贡献率分别为３４．４％和２８．８％㊂影响林龄为６６ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子为硝态氮，贡献率为５０．１％㊂这说明林龄为３０㊁４５ａ时，白桦林生长过程受碳素影响较大，林龄为６６ａ时，白桦林生长则受氮素影响较大㊂微生物生物量碳㊁可溶性有机碳是土壤有机碳库中的重要指标，虽然两者只占土壤总有机碳很少的部分，但其直接参与土壤生化反应过程的重要环节，是土壤微生物活动的物质来源和土壤养分循环的驱动力［１４，３０］㊂随林龄增加，林龄为６６ａ的白桦林土壤酶活性受氮素影响较大，这是因为随林分不断生长，土壤中可利用的氮素质量分数降低，限制了土壤微生物活动，从而间接影响白桦林土壤酶活性［３１］㊂此外，硝态氮㊁铵态氮与３个林龄白桦林的４种酶活性呈正相关关系，这一方面反映了土壤酶活性与土壤养分之间的正相关关系，另一方面也说明了土壤氮素促进与土壤碳㊁磷循环相关的酶活性［１－２，３２］㊂土壤水分含量也是影响土壤酶活性的重要因素㊂研究表明，土壤通气性良好的情况下，水分含量越高，养分在土壤中迁移速率越快，微生物与底物之间联系越紧密，这一定程度增强了土壤酶活性［２，１８，２４］㊂通过对大兴安岭多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性研究发现，林龄对土壤酶活性具有显著影响㊂白桦林土壤过氧化氢酶㊁蔗糖酶㊁酸性磷酸酶活性随林龄增加呈先增后降的变化趋势，脲酶活性则随林龄增加而增加㊂林龄为３０ａ的白桦林４种土壤酶活性显著低于林龄为４５㊁６６ａ的㊂６ １０月，不同林龄白桦林４种土壤酶活性呈单峰曲线变化趋势，其中，７ ９月份４种土壤酶活性较高，６㊁１０月份４种土壤酶活性较低㊂４种土壤酶活性均表现为随土层加深而降低的趋势㊂微生物生物量碳是影响林龄为３０ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子，土壤含水率㊁可溶性有机碳是影响林龄为４５ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子；硝态氮是影响林龄为６６ａ的白桦林土壤酶活性的主导因子㊂这说明林龄为３０㊁４５ａ的白桦林土壤酶活性受碳素影响较大，林龄为０３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷６６ａ的白桦林土壤酶活性则主要受氮素影响㊂参㊀考㊀文㊀献［１］㊀宋思宇，陈亚梅，汪涛，等．不同林龄的西藏林芝云杉人工林土壤酶活性及化学计量比特征［Ｊ］．应用与环境生物学报，２０２３，２９（１）：１７８－１８５．［２］㊀罗明霞，胡宗达，刘兴良，等．川西亚高山不同林龄粗枝云杉人工林土壤微生物生物量及酶活性［Ｊ］．生态学报，２０２１，４１（１４）：５６３２－５６４２．［３］㊀ＬＩＪＱ，ＮＩＥＭ，ＰＥＮＤＡＬＬＥ．Ｓｏｉｌｐｈｙｓｉｃｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｒｅｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｈａｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔｏｃｋｓｎｅａｒＳｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ［Ｊ］．Ｇｅｏｄｅｒｍａ，２０２０，３６６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｏｄｅｒｍａ．２０２０．１１４２０１．［４］㊀ＲＡＩＥＳＩＦ，ＢＥＨＥＳＨＴＩＡ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆｓｏｉｌｑｕａｌｉｔｙａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｆｏｒｅｓｔｓｔｏｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｌａｎｄｓ［Ｊ］．ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｉｃａｔｏｒｓ，２０１５，５０：１７３－１８５．［５］㊀ＪＩＡＮＧＹＬ，ＬＥＩＹＢ，ＱＩＮＷ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅａｌｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｃｅｓ⁃ｓｅｓａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｉｎｓｏｉｌｔｈｒｏｕｇｈｅｃｏｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｔｏｉｃｈｉｏｍ⁃ｅｔｒｙａｎｄｇｌｏｍａｌｉｎ⁃ｒｅｌａｔｅｄｓｏｉｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎａｒｅｔｒｅａｔｉｎｇｇｌａｃｉｅｒｆｏｒｅ⁃ｆｉｅｌｄ［Ｊ］．Ｇｅｏｄｅｒｍａ，２０１９，３３８：３１３－３２４．［６］㊀ＬＵＣＡＳ⁃ＢＯＲＪＡＭＥ，ＨＥＤＯＪ，ＣＥＲＤÁＡ，ｅｔａｌ．Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｆｏｒｅｓｔａｇｅｓｔａｎｄａｎｄｆｏｒｅｓｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｒｉｖｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌｓｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｓｏｉｌｎｕｔｒｉｅｎｔｓｃｏｎ⁃ｔｅｎｔｉｎＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎＳｐａｎｉｓｈｂｌａｃｋｐｉｎｅ（ＰｉｎｕｓｎｉｇｒａＡｒ．ｓｓｐ．ｓａｌｚｍａｎｎｉｉ）Ｆｏｒｅｓｔ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１６，５６２：１４５－１５４．［７］㊀段春燕，何成新，徐广平，等．桂北不同林龄桉树人工林土壤养分及生物学特性［Ｊ］．热带作物学报，２０１９，４０（６）：１２１３－１２２２．［８］㊀范媛媛，李懿，李启迪．不同林龄油松土壤微生物㊁酶活性和养分特征［Ｊ］．水土保持研究，２０１９，２６（６）：５８－６４．［９］㊀赵海燕，徐福利，王渭玲，等．秦岭地区华北落叶松人工林地土壤养分和酶活性变化［Ｊ］．生态学报，２０１５，３５（４）：１０８６－１０９４．［１０］㊀余春和，曾珠，韦秋思，等．不同林龄光皮桦林土壤养分含量与酶活性相关关系［Ｊ］．湖北农业科学，２０２３，６２（５）：５４－５８．［１１］㊀高明磊，满秀玲，段北星．林下植被和凋落物对我国寒温带天然林土壤ＣＯ２通量的短期影响［Ｊ］．北京林业大学学报，２０２１，４３（３）：５５－６５．［１２］㊀ＺＨＯＵＹ，ＨＡＲＴＥＭＩＮＫＡＥ，ＳＨＩＺ，ｅｔａｌ．Ｌａｎｄｕｓｅａｎｄｃｌｉ⁃ｍａｔｅｃｈａｎｇｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｓｏｉｌｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｉｎＮｏｒｔｈａｎｄＮｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１９，６４７：１２３０－１２３８．［１３］㊀尚友贤，满秀玲，徐志鹏．寒温带多年冻土区白桦树干液流及对降雨的响应［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２０２３，４３（６）：１２５－１３６．［１４］㊀ＷＥＩＨ，ＭＡＮＸＬ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｌｉｔｔｅｒｇｒｅａｔｌｙｅｎｈａｎｃｉｎｇｓｏｉｌｒｅｓｐｉｒａ⁃ｔｉｏｎｉｎＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａｆｏｒｅｓｔｓｏｆｐｅｒｍａｆｒｏｓｔｒｅｇｉｏｎ，ｎｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｓｔｓ，２０２１，１２（１）．ｄｏｉ：１０．３３９０／Ｆ１２０１００８９．［１５］㊀张頔，满秀玲，刘思琪，等．寒温带地区非生长季典型森林群落凋落物分解及养分释放［Ｊ］．北京林业大学学报，２０２２，４４（３）：６５－７４．［１６］㊀张雅茜，方晰，冼应男，等．亚热带区４种林地土壤微生物生物量碳氮磷及酶活性特征［Ｊ］．生态学报，２０１９，３９（１４）：５３２６－５３３８．［１７］㊀胡延杰，翟明普，武觐文，等．杨树刺槐混交林及纯林土壤酶活性的季节性动态研究［Ｊ］．北京林业大学学报，２００１，２３（５）：２３－２６．［１８］㊀肖瑞晗，满秀玲，丁令智．坡位对寒温带天然樟子松林土壤微生物生物量碳氮的影响［Ｊ］．北京林业大学学报，２０２０，４２（２）：３１－３９．［１９］㊀李文杰，张祯皎，赵雅萍，等．刺槐林恢复过程中土壤微生物碳降解酶的变化及与碳库组分的关系［Ｊ］．环境科学，２０２２，４３（２）：１０５０－１０５８．［２０］㊀郭辉，唐卫平．不同林龄华北落叶松根际与非根际土壤酶和土壤微生物研究［Ｊ］．生态环境学报，２０２０，２９（１１）：２１６３－２１７０．［２１］㊀牛小云，孙晓梅，陈东升，等．辽东山区不同林龄日本落叶松人工林土壤微生物㊁养分及酶活性［Ｊ］．应用生态学报，２０１５，２６（９）：２６６３－２６７２．［２２］㊀魏红．大兴安岭白桦林主要生态过程碳氮变化及模型模拟［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０２２．［２３］㊀马书琴，汪子微，陈有超，等．藏北高寒草地土壤有机质化学组成对土壤蛋白酶和脲酶活性的影响［Ｊ］．植物生态学报，２０２１，４５（５）：５１６－５２７．［２４］㊀ＤＩＥＮＶＴＭ，曾健勇，满秀玲．樟子松天然林土壤碳氮含量与水解酶活性坡位差异及月动态［Ｊ］．林业科学，２０２０，５６（２）：４０－４７．［２５］㊀高晶，韩海荣，康峰峰，等．冀北辽河源不同林龄油松天然次生林土壤微生物生物量及酶活性［Ｊ］．东北林业大学学报，２０１５，４３（９）：７８－８３．［２６］㊀赵满兴，杨帆，马文全，等．黄土丘陵区沙棘人工林土壤养分及酶活性季节变化［Ｊ］．水土保持研究，２０２３，３０（２）：５８－６６．［２７］㊀陈佳，姚成硕，林勇明，等．武夷山林地土壤酶活性差异及土壤肥力质量评价［Ｊ］．山地学报，２０２１，３９（２）：１９４－２０６．［２８］㊀孙永磊，卢泽洋，周金星，等．喀斯特断陷盆地典型林地土壤酶活性及理化性质研究［Ｊ］．北京林业大学学报，２０２０，４２（２）：４０－４８．［２９］㊀ＸＩＡＯＷＪ，ＣＨＥＮＸ，ＪＩＮＧＸ，ｅｔａｌ．Ａｍｅｔａ⁃ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｏｉｌｅｘ⁃ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｇｌｏｂａｌｃｈａｎｇｅ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８，１２３：２１－３２．［３０］㊀黄卫丽，海龙，吴振廷，等．毛乌素沙地杨柴灌木林恢复演替过程中土壤活性有机碳组分变化特征［Ｊ］．生态学报，２０２３，４３（９）：３７９８－３８０６．［３１］㊀闫本帅，孙利鹏，李晶晶，等．辽东栎林次生演替过程中土壤酶化学计量特征变化［Ｊ］．生态学杂志，２０２２，４１（４）：６４１－６４７．［３２］㊀丁令智，满秀玲，肖瑞晗．大兴安岭北部主要树种生长季根际土壤氮素含量特征［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２０１９，３９（２）：６５－７１，９２．１３１第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘巧娟，等：寒温带多年冻土区不同林龄白桦林土壤酶活性动态特征。
稻麦轮作磷肥减施下水稻土磷素生物有效性特征
稻麦轮作磷肥减施下水稻土磷素生物有效性特征袁佳慧;汪玉;王慎强;赵品恒;王宏燕;陈浩;朱文彬【摘要】土壤磷素化学分级提取方法被广泛应用于磷素状态及特征分析,但相关提取方法缺乏土壤根际过程的表征.基于磷素的根际过程特点,采用一种磷素生物有效性(the biologically-based phosphorus,BBP)分级方法,研究太湖稻麦轮作区磷肥减施定位试验田实施7a后麦季收获期土壤磷素生物有效性及其影响因素.结果表明:就宜兴试验田而言,稻季不施磷麦季施磷处理(PW) CaCl2-P含量与稻麦季均施磷处理(PR+W)之间无显著差异,Citrate-P、HCl-P和Enzyme-P含量则差异显著(P＜0.05).就常熟试验田而言,不同磷肥减施方式对各磷组分含量总体无显著影响,仅Pzero处理HCl-P含量与PR+W处理相比明显降低.两块试验田用BBP法提取的4种土壤磷组分含量与有效磷含量之间的决定系数(R2)不同:宜兴有效磷主要来自Citrate-P(R2=0.587,P＜0.01)、HCl-P(R2=0.587,P＜0.01)和Enzyme-P(R2=0.531,P＜0.01),常熟有效磷主要来自HCl-P(R2=0.386,P＜0.05)和Citrate-P(R2=0.280,P＜0.05).4种磷组分含量由大到小依次为HCl-P、Citrate-P、Enzyme-P和CaCl2-P.冗余分析结果表明,土壤pH、碱性磷酸酶(S-ALP)是影响磷组分变化的重要因素,与土壤磷组分间存在一定的正相关关系.认为该研究结果能加深对减磷条件下土壤磷素生物有效性的理解.【期刊名称】《生态与农村环境学报》【年(卷),期】2018(034)007【总页数】7页(P599-605)【关键词】生物分级;生物有效性;环境因子;麦季;水稻土【作者】袁佳慧;汪玉;王慎强;赵品恒;王宏燕;陈浩;朱文彬【作者单位】东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨 150030;土壤与农业可持续发展国家重点实验室/中国科学院南京土壤研究所,江苏南京210008;土壤与农业可持续发展国家重点实验室/中国科学院南京土壤研究所,江苏南京210008;土壤与农业可持续发展国家重点实验室/中国科学院南京土壤研究所,江苏南京210008;常熟市农业科学研究所,江苏常熟215500;东北农业大学资源与环境学院,黑龙江哈尔滨 150030;土壤与农业可持续发展国家重点实验室/中国科学院南京土壤研究所,江苏南京210008;土壤与农业可持续发展国家重点实验室/中国科学院南京土壤研究所,江苏南京210008【正文语种】中文【中图分类】X501磷是植物生长发育的必需营养元素之一[1-2],但过量施用磷肥会增加磷随径流或向下淋洗流失的风险[3]。
土壤酸性蛋白酶(Solid -Acid Protease,S-ACPT)试剂盒使用说明
土壤酸性蛋白酶（Solid-Acid Protease，S-ACPT）试剂盒使用说明微量法货号：BC0865规格：100管/48样产品内容：试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL蒸馏水充分溶解待用；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入50uL试剂七使粉剂润湿，然后加入10mL试剂一，转入烧杯中沸水浴磁力搅拌溶解后待用；试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入50mL蒸馏水充分溶解待用；试剂五：液体3mL×1瓶，4℃保存；试剂六：液体1.5mL×1支，0.05mg/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存；试剂七：液体1.5mL×1支，4℃保存；产品说明：土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。
S-ACPT在酸性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
酸性条件下，S-ACPT可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
所需仪器及设备：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、双蒸水。
操作步骤：一、测定操作：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、试剂二、三和四40℃水浴10min。
3、样本测定：试剂名称测定管对照管风干土样（g）0.010.01试剂一（μL）50150试剂三（μL）100混匀，40℃水浴30min，振荡5-6次，使土样与反应液充分接触试剂二（μL）100100混匀，8000rpm25℃离心10min，取上清液，在EP管或96孔板中加入下列试剂测定管对照管标准管上清液（μL）3030试剂六（μL）30试剂四（μL）140140140试剂五（μL）303030混匀，40℃水浴20min，680nm下读取各管吸光值A注意：标准管只需测一次。
喀斯特地区植物根系分泌物酶活性对根际土酶活性和养分的影响
它们之间的关系ꎮ 结果表明:( １) 根际土以及根系分泌物的 ４ 种酶活性在植被恢复后期显著高于植被恢复
前期ꎻ乔木林的根系分泌物酶活性 Ｃ ∶ Ｐ 和 Ｎ ∶ Ｐ 比值显著高于其他植被恢复阶段ꎬ而根际土酶活性这 ２ 个
Ｎ ∶ Ｐ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ ｉｎ ａｒｂｏｒ ｆｏｒｅｓｔ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｇｅｓꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｔｗｏ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌｓ ｗｅｒｅ ｏｐｐｏｓｉｔｅ. (２) Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌｓ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ
ｔｈｅ ｌａｔｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｃ ∶ Ｐ ｔｏ
中图分类号: Ｑ９４８.１２ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２( ２０２４) ０３￣０４６５￣１２
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｎ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶1.土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2.Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
（用缓冲液配制）；取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、-1浓度的酚标准溶液梯度。
30min后比色测定。
绘制标准曲0.0018、0.0022和0.0026mg?g线。
5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。
土壤酸性磷酸酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。
⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4mL ph6.5磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。
⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。
表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.080.090.100.110.12 H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.720.710.700.690.68pNP的含量（?mol）0、0.005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.00040.000450.00050.000550.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL）40.5mol/L CaCl2（mL）10.5mol/L NaOH（mL）4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(２):１１１~１１７ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０２.０１５收稿日期:２０２３－０４－１２基金项目:湖南省自然科学基金项目(２０２２ＪＪ５０２２５)ꎻ湖南省教育厅科学研究项目(２０ｂ５２９ꎬ２０Ａ４５１)ꎻ国家大学生创新创业项目(２０２２１０５４７０２３)作者简介:黎颖惠(１９８７ )ꎬ女ꎬ硕士ꎬ讲师ꎬ主要研究方向为微生物生态学ꎮＥ－ｍａｉｌ:２０４３４８８９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:杨贤均(１９７４ )ꎬ男ꎬ硕士ꎬ教授ꎬ主要研究方向为农业生态学ꎮＥ－ｍａｉｌ:２９７８５０７４＠ｑｑ.ｃｏｍ磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响黎颖惠ꎬ邢肖毅ꎬ仇旭ꎬ许仕荣ꎬ倪绯ꎬ赵炼ꎬ杨贤均(邵阳学院农林生态学院ꎬ湖南邵阳㊀４２００００)㊀㊀摘要:为明确施用磷肥对土壤磷活化的影响及微生物驱动机制ꎬ以为红壤区磷肥管理和高效利用提供理论依据ꎬ本试验以红壤区稻田土为供试材料ꎬ采用室内培养法ꎬ施入磷酸二氢钾ꎬ设置磷素水平分别为２０(Ｐ２０)㊁５０(Ｐ５０)㊁８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０)ꎬ２５ħ下培养一周ꎬ研究不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性及解磷菌分布的影响ꎮ结果表明ꎬ土壤磷有效性指数(土壤有效磷增加量占施磷量的百分比)随施磷量的增加而升高ꎮ磷素施用量为２０㊁５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷含量分别提升４.５３㊁１２.６５㊁２５.６９ｍｇ/ｋｇꎬ土壤磷有效性指数分别为２２.６５％㊁２５.３０％和３２.１１％ꎮ土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶和碱性磷酸酶ꎬ且酸性磷酸酶对磷肥的响应更强烈ꎬＰ５０处理土壤磷酸酶活性最高ꎬ其次是Ｐ２０处理ꎬＰ８０处理最低ꎮｐｈｏＤ高通量测序结果表明ꎬ施用磷肥显著降低土壤中含ｐｈｏＤ基因解磷菌的α多样性ꎬ影响解磷菌的群落组成ꎬＰ５０处理的ＯＴＵ７６９(未知类群)相对丰度高达约３０％ꎬ可能促进了磷酸酶活性及有效磷含量的增加ꎮＰ８０处理的ＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５(假单胞杆菌)总相对丰度约５０％ꎬ二者可能更多通过分泌有机酸溶解无机磷以增加有效磷含量ꎮ较高的磷肥施用量提高了有效磷供给效率ꎬ磷酸酶活性的增加可能是中等磷肥用量处理下有效磷增加的重要原因之一ꎬ而高磷肥用量处理下假单胞杆菌对无机磷的溶解可能起更重要的作用ꎮ关键词:磷肥ꎻ磷活化ꎻ稻田土壤ꎻ有效磷ꎻ磷酸酶ꎻｐｈｏＤꎻ解磷菌中图分类号:Ｓ１５４.２㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０２－０１１１－０７ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＲａｔｅｏｎＰｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅＳｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｉｎＰａｄｄｙＳｏｉｌＬｉＹｉｎｇｈｕｉꎬＸｉｎｇＸｉａｏｙｉꎬＱｉｕＸｕꎬＸｕＳｈｉｒｏｎｇꎬＮｉＦｅｉꎬＺｈａｏＬｉａｎꎬＹａｎｇＸｉａｎｊｕｎ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＦｏｒｅｓｔｒｙＥｃｏｌｏｇｙꎬＳｈａｏｙａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｙａｎｇ４２００００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｉｓｐａｐｅｒａｉｍｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ(Ｐ)ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｏｎｓｏｉｌＰａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｏ￣ｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｒｉｖｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇꎬａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒＰｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｍａｎ￣ａｇｅｍｅｎｔａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｕｓｅ.ＲｅｄｐａｄｄｙｓｏｉｌｗａｓｕｓｅｄａｓｍａｔｅｒｉａｌꎬａｎｄＰｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ(ＫＨ２ＰＯ４)ｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄａｔｒａｔｅｓｏｆ２０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ２０)ꎬ５０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ５０)ａｎｄ８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０).Ｔｈｅｓｏｉｌｗａｓｉｎｃｕｂａｔｅｄａｔ２５ħｆｏｒａｗｅｅｋｂｙｉｎｄｏｏｒｃｕｌｔｕｒｅꎬａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｓｏｉｌａｖａｉｌａｂｌｅＰ(ＡＰ)ｃｏｎｔｅｎｔꎬｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ(ＰＳＢ)ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｉｎｄｅｘ(ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＡＰｉｎｃｒｅｍｅｎｔｔｏｔｏｔａｌＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅ)ｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ.ＡＰｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄｂｙ４.５３ꎬ１２.６５ａｎｄ２５.６９ｍｇ/ｋｇｕｎｄｅｒＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆ２０ꎬ５０ꎬａｎｄ８０ｍｇ/ｋｇꎬｗｉｔｈＰｅｆｆｅｃ￣ｔｉｖｅｎｅｓｓｉｎｄｅｘｅｓｗａｓ２２.６６％ꎬ２５.３０％ａｎｄ３２.１１％ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｏｉｌａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ(ＡＣＰ)ｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｅｕｔｒａｌａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅꎬｗｈｉｃｈｗａｓｍｏｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎻｔｈｅａｃ￣ｔｉｖｉｔｙａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ５０ｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＰ２０ａｎｄＰ８０ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ.ＡｌｐｈａｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｐｈｏＤ￣ｃｏｎｔａｉ￣ｎｉｎｇＰＳＢｉｎｓｏｉｌｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓａｆｆｅｃｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＯＴＵ７６９(ｕｎｋｎｏｗｎｔａｘａ)ｗａｓａｂｏｕｔ３０％ｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ５０ꎬｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｖａｉｌａｂｌｅＰｃｏｎｔｅｎｔ.ＴｈｅｔｏｔａｌｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＯＴＵ１０３６ａｎｄＯＴＵ９７５(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)ｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ８０ｗａｓｕｐｔｏ５０％ꎬｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｎｏｒｇａｎｉｃＰｂｙｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎ.ＴｏｓｕｍｕｐꎬｔｈｅｈｉｇｈｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｉｍｐｒｏｖｅｄｓｕｐｐｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＡＰꎬａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｍｉｇｈｔｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅａ￣ｓｏｎｓｆｏｒＡＰｉｎｃｒｅａｓｅｕｎｄｅｒｍｅｄｉｕｍＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｗｈｅｒｅａｓｉｎｏｒｇａｎｉｃＰｄｉｓｓｏｌｖｅｄｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｈｏｕｌｄｐｌａｙｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇＡＰｃｏｎｔｅｎｔｕｎｄｅｒｈｉｇｈＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒꎻＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎꎻＰａｄｄｙｓｏｉｌꎻＡｖａｉｌａｂｌｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎻＰｈｏｓｐｈａ￣ｔａｓｅꎻｐｈｏＤꎻＰｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ㊀㊀磷素是植物生长必需的大量元素之一[１]ꎬ我国农田土壤普遍缺磷ꎮ一般认为ꎬ有效磷含量低于１０ｍｇ/ｋｇ的土壤即为缺磷土壤ꎮ而我国湖南㊁江西㊁广西㊁云南等典型红壤区ꎬ土壤有效磷含量多在５ｍｇ/ｋｇ左右ꎬ远低于世界平均水平ꎮ施用磷肥是提高土壤有效磷含量的重要途径ꎬ红壤区磷肥投入水平往往较高[２]ꎮ然而ꎬ红壤富含铁铝矿物ꎬ对磷素具有极强的结合固定能力ꎬ研究显示约有８０％的磷肥进入红壤后ꎬ通过吸附㊁共沉淀等过程被土壤颗粒快速固定ꎬ成为难以被作物吸收利用的固定形态[３]ꎬ导致土壤中固定态磷大量蓄积[４]ꎮ因此ꎬ红壤中存在着有效磷不足与固定态磷盈余的双重问题ꎮ活化土壤磷库ꎬ开发和有效利用被土壤固定的磷ꎬ提高土壤磷素利用效率ꎬ是解决上述矛盾的关键ꎮ有研究表明ꎬ适量施用磷肥不仅可以补充外源速效磷ꎬ还可降低土壤对磷酸根的吸附量[５]ꎬ甚至促进土壤本底磷的矿化[６－７]ꎬ提高土壤供磷能力[８]ꎮＢａｕｋｅ等[９]对磷肥施用条件下土壤本底磷释放能力的研究结果表明ꎬ相较于不施磷肥ꎬ适量施用磷肥更有利于底层土壤固定态磷的释放ꎮ土壤中分布着大量的解磷菌ꎬ是土壤磷活化的主要驱动者[１０－１２]ꎬ可通过分泌磷酸酶促进有机磷的活化[１３]ꎮ解磷菌在自然状态下ꎬ多处于休眠或潜在活跃状态ꎬ解磷效率较低[１４]ꎮ适当施用磷肥可刺激解磷菌的生长ꎬ激发土壤本底无效磷的释放[７ꎬ１３ꎬ１５－１６]ꎮ李春越等[７]基于分离培养法研究发现ꎬ适当施用磷肥[６０ｋｇ/(ｈｍ２ ａ)]可提高黄土区农田土壤有机磷和无机磷细菌丰度ꎬ且有机磷细菌对磷肥更为敏感ꎬ最终促进有机磷矿化ꎮ微生物对有机磷的活化主要指磷酸酶的矿化作用ꎬ其中碱性磷酸酶几乎特异性地来源于微生物[１３ꎬ１７]ꎬ因此被认为是有机磷微生物活化过程的重要驱动者ꎮ碱性磷酸酶的编码基因ｐｈｏＤ由于分布广泛ꎬ活性强㊁多样性高ꎬ被广泛应用于土壤有机磷转化过程的研究ꎮ已有研究表明ꎬ当土壤适量施用化学磷肥时ꎬ可提高含ｐｈｏＤ基因的解磷菌丰度及某些特定类群的相对丰度ꎬ继而增加磷酸酶活性ꎬ提高土壤有效磷含量[１３ꎬ１７－１８]ꎮ例如ꎬ当土壤中施入５０ｍｇ/ｋｇ的磷素时ꎬ相较于不施磷肥和２００ｍｇ/ｋｇ的施磷处理ꎬ其ｐｈｏＤ基因丰度最高ꎬ且不同用量磷肥施用条件下ꎬ解磷菌的组成不同[１８]ꎮ然而ꎬ当化学磷肥施用量较大时ꎬ会抑制解磷菌的生长和磷酸酶的合成[１３ꎬ１８]ꎮ尽管目前关于磷活化的研究已经较多ꎬ但是对于红壤区磷肥施用量对土壤磷活化及解磷菌群落结构影响的研究还比较少见ꎬ解磷菌在磷活化中的作用尚不明确ꎮ为此ꎬ本研究以红壤区稻田土壤为材料ꎬ对比分析磷肥不同施用量处理下ꎬ土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性的变化ꎬ以及含ｐｈｏＤ基因解磷菌的群落特征ꎬ明确磷肥施用对土壤磷活化的影响及其微生物驱动机制ꎬ以期为红壤区磷肥高效利用提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试土壤和培养方法２０２０年１０月在湖南省邵阳市红壤区采集稻田０~２０ｃｍ土层土壤ꎬ土壤有效磷含量为１１.３９２１１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｍｇ/ｋｇꎮ土样风干过２ｍｍ筛后ꎬ调节土壤水分为２５％孔隙充水度(２５％ＷＦＰＳ)ꎬ２５ħ培养一周以恢复微生物活性ꎮ以磷酸二氢钾形式施入磷肥ꎬ磷素设置２０(Ｐ２０)㊁５０(Ｐ５０)㊁８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０)３个水平ꎬ调节土壤水分为６０％田间持水量ꎬ每个处理称取５０ｇ土壤ꎬ于１００ｍＬ玻璃培养钵中进行好氧培养ꎬ每处理重复３次ꎬ在２５ħ下培养一周ꎮ１.２㊀样品采集、测定项目及方法培养结束后ꎬ充分混匀培养钵中的土壤样品ꎬ取约１０ｇ样品置于－８０ħ条件下保存ꎬ用于测定含ｐｈｏＤ基因解磷菌群落结构ꎬ其余样品于４ħ保存ꎬ用于测定土壤有效磷含量和磷酸酶活性ꎮ土壤总ＤＮＡ的提取采用ｍｏｂｉｏ试剂盒ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌的扩增引物为ＡＬＰＳ－７３０Ｆ(ＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＴ)和ＡＬＰＳ－１１０１Ｒ(ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＣＧ)[６]ꎮ扩增条件为９５ħ５ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５８ħ３０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ高通量测序平台为Ｉｌｌｕｍｉ￣ｎａꎬ由上海美吉生物医药科技有限公司完成ꎬ测序数据按９７％序列相似度划分ＯＴＵꎮ土壤有效磷含量采用钼蓝比色法测定ꎬ土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法ꎬ酸性㊁中性㊁碱性磷酸酶的缓冲液分别为醋酸㊁柠檬酸和硼酸缓冲液ꎮ１.３㊀数据处理与分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１７整理数据ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０软件进行统计分析ꎮα多样性指数中ꎬＡｃｅ和Ｃｈａｏ１指数用来估计样本中ＯＴＵ数目ꎬＳｉｍｐ￣ｓｏｎ和Ｓｈａｎｎｏｎ指数用来估计样本中微生物的多样性ꎮ土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性以及含ｐｈｏＤ解磷菌α多样性的比较采用单因素方差分析(Ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ)ꎬＤｕｎｃａｎ ｓ法进行差异显著性检验(Ｐ<０.０５)ꎮ采用主成分分析法(ＰＣＡ)分析土壤解磷菌群落结构ꎬ数据可视化采用Ｃａｎｏｃｏ４.５软件进行ꎮ将ＯＴＵ代表序列运用ＢＬＡＳＴ进行序列对比(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)ꎬ明确分类信息ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量的影响磷肥施用量显著影响土壤有效磷含量(图１)ꎮ供试土壤原始有效磷含量为１１.３９ｍｇ/ｋｇꎬ施加２０㊁５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ磷素后ꎬ土壤有效磷含量分别升至１５.９２㊁２４.０４㊁３７.０８ｍｇ/ｋｇꎬ仅分别增加４.５３㊁１２.６５㊁２５.６９ｍｇ/ｋｇꎮ可见施入土壤中的磷肥被大量固定ꎬ只有小部分转化为有效磷ꎮ三种施肥量条件下ꎬ土壤磷有效性指数(土壤有效磷增加量占施磷量的百分比)分别为２２.６５％㊁２５.３０％和３２.１１％ꎬ表明随着磷肥施用量的增加ꎬ有更高比例的磷素转化为土壤有效磷ꎮ柱上不同小㊁大写字母分别表示土壤有效磷增量及土壤磷有效性指数不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图１㊀不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量的影响２.２㊀不同磷肥用量对稻田土壤磷酸酶活性的影响由图２可见ꎬ整体而言ꎬ土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶ꎬ碱性磷酸酶活性最低ꎬ表明土壤酸性磷酸酶对磷肥的响应更为强烈ꎮ随磷肥施用量的增加ꎬ土壤酸性磷酸酶活性呈先增加后降低趋势ꎬＰ５０处理条件下活性最高ꎬ达４.０６ｍｇ ｇ－１ ｄ－１ꎬ显著高于Ｐ２０和Ｐ８０处理ꎬ而后二者间无显著差异ꎮ中性磷酸酶和碱性磷酸酶活性也表现为Ｐ５０处理最高ꎬ但３个施肥处理间差异较小ꎬ均未达显著水平ꎮ柱上不同小写字母代表不同施肥量处理下同类型磷酸酶活性在０.０５水平上差异显著ꎮ图２㊀不同磷肥用量条件下土壤磷酸酶活性２.３㊀不同磷肥用量对稻田土壤解磷菌α多样性的影响土壤中含ｐｈｏＤ基因解磷菌的Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１和３１１㊀第２期㊀㊀㊀㊀黎颖惠ꎬ等:磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响Ｓｈａｎｎｏｎ指数均随磷肥施用量的增加而显著降低ꎬ而Ｓｉｍｐｓｏｎ则呈现相反趋势(表１)ꎮ与Ｐ２０处理相比ꎬＰ５０㊁Ｐ８０处理下解磷菌Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数分别降低１４.９％㊁３０.３％㊁１５.０％㊁２７.７％和１３.１％㊁２５.０％ꎮＳｉｍｐｓｏｎ指数则以Ｐ２０处理最低ꎬ与Ｐ５０和Ｐ８０处理差异达显著水平ꎬ但后两者无显著差异ꎮ综上可知ꎬ施用磷肥导致土壤解磷菌的丰富度和多样性显著降低ꎬ且施肥量越大ꎬ降幅越大ꎮ㊀㊀表１㊀不同磷肥用量处理下土壤中含ｐｈｏＤ解磷菌的α多样性指数磷素用量/(ｍｇ/ｋｇ)ＡｃｅＣｈａｏ１ＳｈａｎｎｏｎＳｉｍｐｓｏｎ２０７７２ʃ２８ａ７７３ʃ２９ａ４.１２ʃ０.１２ａ０.０４ʃ０.００１ｂ５０６５７ʃ３０ｂ６５７ʃ３２ｂ３.５８ʃ０.２２ｂ０.１１ʃ０.００１ａ８０５３８ʃ２６ｃ５５９ʃ２７ｃ３.０９ʃ０.１５ｃ０.１２ʃ０.００２ａ㊀㊀注:同列数据后不同小写字母表示不同处理下α多样性指数在０.０５水平上差异显著ꎮ２.４㊀不同磷肥用量对稻田土壤解磷菌群落组成的影响对含ｐｈｏＤ基因解磷菌的群落结构进行ＰＣｏＡ分析(图３)ꎬ前两轴对总变异的累积贡献率为７８.２％ꎮ相同磷用量处理的土壤样品在ＰＣｏＡ图上相对聚集ꎬ而不同用量处理的样品则明显分开ꎬ表明施用磷肥强烈影响含ｐｈｏＤ解磷菌的群落结构ꎮ图３㊀不同磷肥用量条件下土壤解磷菌群落ＰＣｏＡ图对相对丰度大于５％的ＯＴＵ绘制解磷菌群落组成图(图４)ꎬ可以看出三种施肥量条件下土壤解磷菌组成差异明显ꎮ总体而言ꎬＯＴＵ７６９相对丰度最大ꎬＰ５０处理下达到近３０％ꎬ其次分别是Ｐ８０和Ｐ２０处理ꎬ相对丰度分别为２０.０９％和９.７６％ꎮ将其代表序列在ＮＣＢＩ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ未比对上已有序列ꎮＯＴＵ１０３６同样具有较高的丰度ꎬ尤其是Ｐ８０处理相对丰度为２４.９３％ꎬ而Ｐ２０和Ｐ５０处理相对丰度均在１０％左右ꎮ另外ＯＴＵ９７５也对施肥表现出明显响应ꎬ且其相对丰度同样以Ｐ８０处理最高ꎬ为１１.７４％ꎬ而其他两个处理下相对丰度均在５％左右ꎮ根据序列比对ꎬＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５可能从属于假单胞杆菌属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)ꎮ图４㊀不同磷肥用量条件下土壤解磷菌群落组成图３㊀讨论本试验结果表明ꎬ施用外源磷肥显著提高土壤有效磷含量ꎬ且随磷肥用量的增加ꎬ土壤有效磷含量升高ꎬ但土壤有效磷的增加量远低于外源补充的磷量ꎮ由此可见ꎬ大量的外源磷肥被土壤颗粒所固定ꎮ这是因为红壤富含铁铝矿物ꎬ对磷素具有极强的结合固定能力ꎮ本研究中ꎬ当磷素施用量为２０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷仅增加４.５３ｍｇ/ｋｇꎬ约为施用量的２２％ꎮ而当施磷量增加至５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷增加量占施用量的比重有所提高ꎬ分别为２５.３０％㊁３２.１１％ꎮ即随磷肥施用量的增加ꎬ有更高比例的磷素转化为有效磷ꎮ向晓玲等[１９]研究也发现ꎬ易解吸磷随施磷量的增加而增加ꎮ另外ꎬ较高的磷肥用量也可能促进了土壤磷的活化ꎮ马殿叶[２０]研究发现ꎬ磷素活化系数随磷肥施用量的增加而升高ꎮ解磷微生物分泌磷酸酶对有机磷进行矿化[６ꎬ１８]是磷活化的重要途径之一ꎮ本研究发现ꎬ土壤酸性㊁中性㊁碱性磷酸酶活性均表现为Ｐ５０处理最高ꎬ其次为Ｐ２０和Ｐ８０处理ꎬ并且以酸性磷酸酶最为敏感ꎮ已有研究证明酸性磷酸酶在红壤中具有较高的活性[２１－２２]ꎮ另外ꎬ酸性磷酸酶活４１１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀性易受土壤有效磷含量的影响[２３－２４]ꎮ当土壤本底磷含量较低时ꎬ适当的磷素投入会刺激磷酸酶的表达以满足微生物的需求[５ꎬ２５]ꎬ而过高的投入由于缓解了微生物的磷饥饿ꎬ磷酸酶的分泌减少[１６ꎬ２４]ꎮ马殿叶[２０]研究表明ꎬ当磷肥施用量为５０ｋｇ/ｈｍ２时ꎬ磷酸酶活性高于０㊁２５㊁１００㊁２００ｋｇ/ｈｍ２和４００ｋｇ/ｈｍ２处理ꎮ磷酸酶活性的增加可能会导致有机磷的矿化ꎬ从而提高土壤有效磷含量ꎬ有研究表明土壤磷酸酶活性与有效磷含量呈显著正相关[２６－２７]ꎮ然而ꎬ本研究中ꎬ磷酸酶活性以Ｐ５０处理最高ꎬ而磷的有效性指数以Ｐ８０处理最高ꎬ磷酸酶活性与有效磷的增量并未表现出显著的相关性ꎬ由此可见ꎬ磷酸酶活性的改变并不是磷有效性指数变化的主要因素ꎮ施用磷肥之所以提高土壤磷有效性指数ꎬ可能是因为较高磷肥用量降低了土壤的磷素吸附能力ꎮ有研究发现ꎬ随磷肥施用量的增加ꎬ土壤中高能吸附点位逐渐饱和ꎬ磷的吸附转为低能吸附ꎬ因而土壤吸附量降低ꎬ而解吸量增加[２８－２９]ꎮ另外ꎬ本研究施用的磷肥为磷酸二氢钾ꎬ可导致土壤ｐＨ值的降低ꎬ从而促进无机磷的溶解ꎬ最终影响土壤有效磷含量ꎮ综上所述ꎬ本研究发现ꎬ施用适量磷素(５０ｍｇ/ｋｇ)增加了土壤磷酸酶活性ꎬ可能促成了该处理下土壤磷有效性指数的增加ꎬ而高磷施用量处理下(８０ｍｇ/ｋｇ)ꎬ除外源施用的磷素外ꎬ磷吸附量的降低和无机磷溶解量的增加也可能促进了有效磷含量的增加ꎮ磷肥不同施用量处理下ꎬ磷酸酶活性的改变依赖于土壤解磷微生物对施肥的响应ꎮ就多样性而言ꎬ随着磷肥施用量的增加ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌的Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１和Ｓｈａｎｎｏｎ指数显著降低ꎬ而Ｓｉｍｐｓｏｎ则有所增加ꎬ表明磷肥施用导致土壤解磷菌的物种丰富度和多样性降低ꎮ施肥对土壤微生物多样性的影响已有很多研究ꎮ一般认为ꎬ适量施肥ꎬ尤其是无机肥和有机肥配合施用ꎬ可为土壤微生物提供较多的能源和较全面的养分[３０]ꎬ促进多种类群微生物的大量繁殖ꎬ从而提高土壤微生物的多样性[３１]ꎮ而施肥不均衡则可能对微生物群落的多样性产生负效应[３２]ꎮ本研究仅施用了磷酸二氢钾ꎬ未提供碳氮元素ꎬ无法为微生物提供均衡的营养和能源ꎬ可能会导致对磷钾素竞争力高的微生物类群大量繁殖ꎬ争夺大量的能源和营养ꎬ而其他微生物相对减少ꎬ从而降低物种丰富度和多样性ꎮ本研究中Ｐ５０和Ｐ８０处理下ꎬＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５的相对丰度显著增加ꎬ根据序列比对ꎬ二者可能从属于假单胞杆菌ꎮ而以往的研究发现假单胞杆菌对磷素具有较强的竞争力[３３]ꎮ一般认为ꎬ微生物多样性的降低会严重损伤生态系统功能[１８ꎬ３４]ꎮ本研究中ꎬ当磷素施用量为５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ有效磷的相对增量更大ꎮ这可能是因为当多样性降低导致生态系统功能受损时ꎬ微生物通过增加数量㊁改变组成或互作关系等进行功能补偿[３５－３７]ꎮ磷肥不同施用量处理下ꎬ土壤解磷菌群落结构差异显著ꎮＰ５０处理下ꎬＯＴＵ７６９的相对丰度大幅增加ꎬ达到近３０％ꎬ此时磷酸酶活性也最大ꎬ因此推测该类群可能是分泌磷酸酶的主要类群ꎬ但是并未在ＮＣＢＩ数据库中比对到相似序列ꎮＰ８０处理下ꎬＯＴＵ１３０６和ＯＴＵ９７５相对丰度显著增加ꎬ达３６.７％ꎬ根据序列比对ꎬ二者可能从属于假单胞菌ꎮ假单胞菌是红壤中常见的一种强解磷细菌[３８－３９]ꎬ且对磷肥施用敏感[１８]ꎬ其解磷机制主要是通过分泌有机酸溶解固定态无机磷[４０]ꎮ由此推测ꎬ施用磷肥可能促进了土壤中磷的活化ꎬ但不同用量处理下ꎬ解磷菌释放有效磷的方式可能不同ꎬ磷素用量为５０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ解磷菌主要分泌磷酸酶矿化有机磷ꎬ而磷素用量为８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ解磷菌可能更多地通过分泌有机酸实现对无机磷的溶解ꎮ李春越等[７]的研究也证明ꎬ无机解磷菌更偏好高磷环境ꎬ而有机解磷菌更偏好相对较低的磷素环境ꎮ本研究采用差减法计算磷肥施用条件下有效磷活化量ꎬ具有一定的不准确性ꎬ未来将采用同位素标记准确定量磷活化量ꎮ另外ꎬ本试验仅研究了磷肥施用条件下解磷菌和磷酸酶活性的变化ꎬ尚不足以阐明磷活化机制ꎬ未来的研究中将进一步关注有机酸组分及其含量的变化ꎬ溶无机磷和解有机磷微生物的分布特征ꎬ并从ｍＲＮＡ的角度探索解磷菌的变化特征ꎬ以全面分析磷肥施用对土壤磷转化过程的影响ꎬ揭示土壤有效磷激发的机制ꎮ４㊀结论磷肥施用量影响土壤供磷效率ꎬ在２０~８０５１１㊀第２期㊀㊀㊀㊀黎颖惠ꎬ等:磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响ｍｇ/ｋｇ的磷素用量范围内ꎬ土壤磷有效性指数逐渐增加ꎮ施用磷肥降低了土壤解磷菌的多样性ꎬ同时改变了解磷菌的组成ꎮ磷肥不同用量条件下ꎬ有效磷增加的途径可能不同ꎬ５０ｍｇ/ｋｇ磷素用量条件下ꎬ土壤磷酸酶活性最高ꎬ同时ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌中ＯＴＵ７６９(种属信息未知)相对丰度最高ꎬ推测该物种可能具有分泌磷酸酶的能力ꎬ为促进土壤本底有机磷矿化的主要物种ꎻ８０ｍｇ/ｋｇ磷素处理下ꎬ土壤磷酸酶活性较低ꎬ而假单胞属的相对丰度大幅增加ꎬ推测假单胞菌可能是通过分泌有机酸溶解无机磷ꎬ从而增加有效磷含量ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀高文龙ꎬ张赢心ꎬ卢英进ꎬ等.不同磷素用量对玉米生长及生理生化指标的影响[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(４):９０－９４.[２]㊀ＬｉｕＭꎬＬｉｕＪꎬＣｈｅｎＸＦꎬｅｔａｌ.Ｓｈｉｆｔｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎａｐａｄｄｙｓｏｉｌｆａｃｅｄｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｕｒｐｌｕｓ[Ｊ].Ｂｉ￣ｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０１８ꎬ５４(２):２５９－２６７. [３]㊀ＺｈｕＪＭꎬＫａｅｐｐｌｅｒＳＭꎬＬｙｎｃｈＪＰ.ＭａｐｐｉｎｇｏｆＱＴＬｃｏｎｔｒｏｌ￣ｌｉｎｇｒｏｏｔｈａｉｒｌｅｎｇｔｈｉｎｍａｉｚｅ(ＺｅａｍａｙｓＬ.)ｕｎｄｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＳｏｉｌꎬ２００５ꎬ２７０(２):２９９－３１０. [４]㊀张峰.蚯蚓粪肥对水稻土磷形态转化以及固定态磷活化的影响[Ｄ].贵阳:贵州大学ꎬ２０１９.[５]㊀ＮｉｕＬＡꎬＨａｏＪＭꎬＺｈａｎｇＢＺꎬｅｔａｌ.Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒａｎｄｔｉｌｌａｇｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｎｓｏｉｌｆｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＰｌａｉｎ[Ｊ].Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅꎬ２０１１ꎬ２１(６):８１３－８２０. [６]㊀ＨｕＹＪꎬＸｉａＹＨꎬＳｕｎＱꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｆｅｒｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｎｐｈｏＤ￣ｈａｒｂｏｒｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎＫａｒｓｔｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬ２０１８ꎬ６２８/６２９:５３－６３. 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[１４]ＣｏｌｌａｖｉｎｏＭＭꎬＳａｎｓｂｅｒｒｏＰＡꎬＭｒｏｇｉｎｓｋｉＬＡꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒ￣ｉｓｏｎｏｆｉｎｖｉｔｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｖｅｒｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ￣ｓｏｌｕ￣ｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｎａｔｉｖｅｔｏａｃｉｄｓｏｉｌａｎｄｔｈｅｉｒａｂｉｌｉｔｙｔｏｐｒｏｍｏｔｅＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓｇｒｏｗｔｈ[Ｊ].ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０１０ꎬ４６(７):７２７－７３８.[１５]ＦｒａｓｅｒＴＤꎬＬｙｎｃｈＤＨꎬＢｅｎｔＥꎬｅｔａｌ.ＳｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈｏＤｇｅｎｅａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｐｐｌｉｅｄｐｈｏｓ￣ｐｈｏｒｕｓａｎｄｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｍａｎａｇｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１５ꎬ８８:１３７－１４７.[１６]朱丛飞ꎬ罗汉东ꎬ胡冬南ꎬ等.油茶林土壤生化性对磷素水平的响应研究[Ｊ].中南林业科技大学学报ꎬ２０１７ꎬ３７(２):５７－６２.[１７]ＷｅｉＸＭꎬＨｕＹＪꎬＲａｚａｖｉＢＳꎬｅｔａｌ.Ｒａｒｅｔａｘａｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒａｓｅ￣ｈａｒｂｏｒｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｍｅｄｉａｔｅｓｏｉｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１９ꎬ１３１:６２－７０.[１８]ＬｏｎｇＸＥꎬＹａｏＨＹꎬＨｕａｎｇＹꎬｅｔａｌ.Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｌｅｖｅｌｓｉｎｆｌｕ￣ｅｎｃｅｔｈｅｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｒｈｉｚｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｃａｒｂｏｎａｎｄｔｈｅｐｈｏｓ￣ｐｈａｔｅ￣ｓｏｌｕｂｉｌｉｓｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎａｐａｄｄｙｓｏｉｌ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１８ꎬ１１８:１０３－１１４.[１９]向晓玲ꎬ陈松鹤ꎬ杨洪坤ꎬ等.秸秆覆盖与施磷对四川丘陵旱地土壤磷形态及有效性的影响[Ｊ].应用生态学报ꎬ２０２２ꎬ３３(１２):３３－３７.[２０]马殿叶.不同供磷水平下紫色土磷素赋存及土壤微生物活化利用潜力分析[Ｄ].重庆:西南大学ꎬ２０２１.[２１]王晓萍ꎬ吴洵ꎬ俞永明.红壤茶园磷酸酶活性的研究[Ｊ].茶叶科学:英文ꎬ１９８９ꎬ９(２):９９－１０８.[２２]莫雪ꎬ陈斐杰ꎬ游冲ꎬ等.黄河三角洲不同植物群落土壤酶活性特征及影响因子分析[Ｊ].环境科学ꎬ２０２０ꎬ４１(２):８９５－９０４.[２３]沈菊培ꎬ陈振华ꎬ陈利军.草甸棕壤水稻田土壤磷酸酶活性及对施肥措施的响应[Ｊ].应用生态学报ꎬ２００５ꎬ１６(３):５８３－５８５.[２４]杨文娜ꎬ余泺ꎬ罗东海ꎬ等.土壤ｐｈｏＣ和ｐｈｏＤ微生物群落对化肥和有机肥配施生物炭的响应[Ｊ].环境科学ꎬ２０２２ꎬ４３(２):１０４０－１０４９.[２５]ＷｒｉｇｈｔＡＬꎬＲｅｄｄｙＫＲ.Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｌｏａｄｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎｅｘｔｒａ￣ｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＥｖｅｒｇｌａｄｅｓｗｅｔｌａｎｄｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｍｅｒｉｃａＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ６５(２):５８８－５９５. 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缓冲液种类对土壤酸性磷酸酶活性的影响
常根据 ｐＨ 值将土壤磷酸酶分为酸性磷酸酶 ( ＥＣ
收稿日期: ２０１７ － １１ － ２３ꎻ 最后修订日期: ２０１８ － ０３ － １８
基金项目: 国家重点研发计划 “ 典型脆弱生态修复与保护研究”
重点专项 (２０１６ ＹＦＣ ０５０３４０１ － ０４) ꎮ
作者简介: 唐晓倩 (１９９２ － ) ꎬ 女ꎬ 江苏南通人ꎬ 硕士ꎬ 主要研究
[７ － ８]
、 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ 柠檬酸盐缓冲
液 ( 简称 ＣＩＴＢ) [１４] 以及改进的通用缓冲液 ( 简称
９ ４８
４ ３４
３０ ６７
０ ８６
根据我国大部分土壤 ｐＨ 值为 ４ ~ ９ 的范围ꎬ 以
及有学者将最适 ｐＨ 值 ５ ~ ６ 的磷酸酶定义为酸性磷
酸酶ꎬ 本研究采用的 ｐＨ 值分别为 ４、 ５ 和 ６ꎬ 共 ３
个梯度ꎮ 缓冲液的选择主要基于目前酶测定过程中
广泛应用的 ３ 种类型ꎬ 分别为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ 醋酸盐缓
冲液 ( 简称 ＡＣＥＢ)
托利多酸度计 ( ＦＥ２０Ｋ) 测定ꎮ 土壤有机碳采用高
温外热重铬酸钾氧化 － 容量法测定ꎮ 土壤全氮测定
采用凯氏消煮法ꎬ 定氮仪蒸馏ꎮ 碱解扩散法测土壤
碱解氮ꎮ 土壤有效磷采用碳酸氢钠法测定ꎮ 土壤速
效钾采用乙酸铵提取ꎬ 用火焰光度计测定 [１３] ꎮ 土
壤采样地点和常规指标分析结果见表 １ꎮ
— １６３ —
. All
Rights Reserved.
低ꎬ 对土壤磷素的管理具有重要意义ꎮ 由于分离技
术的限制ꎬ 目前直接从土壤中提取酶尚有一定的难
度ꎮ 因此ꎬ 对土壤磷酸酶活性的测定ꎬ 主要是在土
壤中添加一定数量对硝基苯磷酸二钠基质ꎬ 在一定
碳酸钙和根际作用对酸性红壤解磷微生物丰度的影响
土 壤(Soils), 2020, 52(4): 704–709DOI: 10.13758/ki.tr.2020.04.008郑曼曼, 王超, 沈仁芳. 碳酸钙和根际作用对酸性红壤解磷微生物丰度的影响. 土壤, 2020, 52(4): 704–709.碳酸钙和根际作用对酸性红壤解磷微生物丰度的影响①郑曼曼1,2，王超1*，沈仁芳1,2(1 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中国科学院大学，北京 100049)摘要：选用玉米品种郑单958为试验材料，设置不添加碳酸钙(CK)、每千克土添加0.3 g碳酸钙(Ca-0.3)和0.5 g碳酸钙(Ca-0.5)3个碳酸钙处理，以相应处理未种植物土壤为非根际对照土壤，研究了碳酸钙和根际作用对酸性红壤磷酸酶活性及解磷微生物相关功能基因phoC和phoD丰度的影响。
结果表明：碳酸钙添加能有效改善玉米生长，促进地上部氮、磷、钾和钙的吸收。
土壤酸性磷酸酶(ACP)活性显著高于碱性磷酸酶(ALP)活性，表明酸性土壤中ACP在矿化有机磷方面占主导地位。
根际土壤ACP、ALP活性和phoD基因拷贝数均显著高于非根际，而仅Ca-0.5处理ALP活性和phoD基因拷贝数显著高于CK，说明根际效应强于碳酸钙处理。
phoC基因拷贝数与土壤铵态氮、硝态氮含量存在显著相关性，ALP活性和phoD基因拷贝数与土壤pH及铵态氮、硝态氮、有效磷、交换性钙含量均存在显著相关性。
可见，碳酸钙和根际作用均影响酸性土壤解磷微生物功能和丰度，但根际效应更加明显，这些作用与土壤理化因子的改变密切相关。
关键词：酸性土壤；碳酸钙；磷酸酶；解磷微生物；基因拷贝数中图分类号：S154.3 文献标志码：AEffects of Calcium Carbonate and Rhizosphere on Abundance of Phosphate-Solubilizing Microorganisms in Acidic Red SoilZHENG Manman1,2, WANG Chao1*, SHEN Renfang1,2(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract:Maize variety, Zhengdan 958 was used as experiment material, soils were treated with calcium carbonate (CaCO3) at rates of 0, 0.3, 0.5 g per kg soil while soils treated with no plant were the non-rhizosphere soils, and then the effects of CaCO3 and rhizosphere on phosphatase activity and the abundance of phosphate-solubilizing microorganisms (PSM) associated functional genes phoC and phoD in acidic red soil were studied. Results showed that CaCO3 addition could effectively improve maize growth and promote the absorption of nitrogen, phosphorus, potassium and calcium in maize shoots. Soil acid phosphatase (ACP) activity was significantly higher than alkaline phosphatase (ALP) activity, indicating that the dominated effect of ACP in mineralizing organic P in acidic soils. The ACP, ALP activities and phoD gene copy number in rhizosphere soil were significantly higher than those of non-rhizosphere, while ALP activity and phoD gene copy number under Ca-0.5 treatment were significantly higher than those of CK, indicating that rhizosphere effect was stronger than CaCO3 treatment. phoC gene copy number was significantly correlated with the contents of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen, while both ALP activity and phoD gene copy number were significantly correlated with soil pH and the contents of ammonium nitrogen, nitrate nitrogen, available phosphorus and exchangeable calcium. It can be seen that both CaCO3 and rhizosphere can affect the function and abundance of PSM in acid soil, but the rhizosphere effect is more obvious, which is closely related to the changes of soil physicochemical properties.Key words: Acidic soil; Calcium carbonate; Phosphatase; Phosphorus solubilizing microorganisms; Gene copy number 在中国，酸性土壤(pH<5.5)总面积约2.18亿km2，主要分布在南方热带和亚热带地区[1]。
基于不同方法测定土壤酸性磷酸酶活性的比较
基于不同方法测定土壤酸性磷酸酶活性的比较李莹飞;耿玉清;周红娟;杨英【期刊名称】《中国生态农业学报》【年(卷),期】2016(000)001【摘要】土壤酸性磷酸酶与有机磷的矿化及植物的磷素营养关系最为密切。
目前国内学者在测定酸性磷酸酶活性时主要参照关松荫《土壤酶及其研究法》中以磷酸苯二钠为基质的测定方法,而国外学者主要参照 Dick《Methods of Soil Enzymology》中以对硝基苯磷酸二钠为基质的测定方法(PNPP)。
但是,在以磷酸苯二钠为基质测定生成物的过程中,常出现显色程度不明显的问题；另外,采用不同基质测定酸性磷酸酶活性也造成了测定方法选择的困难。
为合理选择土壤酸性磷酸酶活性的测定方法,本研究选用酸性、中性和碱性土壤各10个土样,分别采用以磷酸苯二钠为基质,且在显色阶段分别加入 pH5.0醋酸盐缓冲液(DPP 1)和 pH9.4硼酸盐缓冲液(DPP 2)的方法,以及PNPP方法测定土壤酸性磷酸酶活性。
同时也研究了不同pH缓冲液和苯酚浓度对生成物显色反应的影响。
结果表明：以磷酸苯二钠为基质、在显色反应阶段加入pH≤6的缓冲液时,苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺不显色；当加入pH≥8的缓冲液时,两者之间显色且苯酚浓度和吸光值的Pearson相关系数极显著。
这说明 pH 低是导致高苯酚浓度和2,6-二溴苯醌氯亚胺显色效果差的一个主要原因。
此外,采用PNPP 方法测定时,在酸性、中性和碱性土壤中,10个样本酸性磷酸酶活性的变异系数分别较 DPP 2增加了70.04%、42.44%和21.17%；极差分别是DPP 2的27.18倍、26.85倍和39.43倍。
总之,如果选用磷酸苯二钠为基质测定土壤酸性磷酸酶活性,应在显色阶段加入碱性硼酸盐缓冲液；选用对硝基苯磷酸二钠为基质,是更为简单和灵敏的方法。
%Soil phosphatase,especially acid phosphatase, plays a critical role in the decomposition of organic phosphorus and has a major impact on plant phosphorus uptake. Most Chinese researchers refer to the book entitled Soil Enzyme and Its Research Method, edited by Songyin Guan, for measurement method of soil acid phosphatase activity based on phenyl phosphate disodium salt substrate. In contrast, researchers outside China mainly cite the book entitled Methods of Soil Enzymology, edited by Dick, that was based on disodium p-Nitrophenyl phosphate tetrahydrate (PNPP) substrate. However, non-conspicuous coloration has existed for the measurement of products based on phenyl phosphate disodium salt substrate. Furthermore, it has been difficult for researchers to select an optimal method for determining acid phosphatase activity since these methods use different substrates. To determine the optimal method for measuring soil acid phosphatase activity, three different methods were used to measure the acid phosphatase activity of 10 soil samples of acid, neutral and alkaline soils, respectively. The three selected methods were 1) based on phenyl phosphate disodium salt substrate and colored using pH 5.0 acetate buffer (DPP 1);2) based on phenyl phosphate disodium salt substrate and colored using pH 9.4 borate buffer (DPP 2) during chromogenic process;or 3) the PNPP method. Furthermore, the study analyzed the effects of different pH buffers and phenol concentrations on product absorbance. The results showed that chromogenic reaction of phenol with 2,6-dibromchinone-chlorimide was colorless within pH≤6 buffer solution with phenyl phosphate disodium salt as the substrate. In contrast, the abovechromog enic reaction was observed under alkaline buffer (pH≥ 8) in all the samples. And there were significant differences in the Pearson correlation coefficient (R2) between phenol concentration and product absorbance at 0.01 level. Therefore, pH was a significant factor in determining the coloration between phenol and 2,6-dibromchinone-chlorimide. Furthermore, when acid phosphatase activity was determined using the PNPP method, the coefficient of variation of acid phosphatase activities in the 10 soil samples increased by 70.04%, 42.44%and 21.17%in acid, neutral and alkaline soils, respectively, which was in sharp contrast to those determined using the DPP 2 method. The range of soil acid phosphatase activities determined by the PNPP method was 27.18, 26.85 and 39.43 times larger than those determined by the DPP 2 method in acid, neutral and alkaline soils, respectively. These results suggested that regardless of soil acidity, PNPP was an easier and more sensitive method than DPP 2 for the estimation of soil acid phosphatase activity. In addition, if phenyl phosphate disodium salt was used as substrate in an assay, alkaline borate was the most suitable buffer for coloration reaction systems.【总页数】7页(P98-104)【作者】李莹飞;耿玉清;周红娟;杨英【作者单位】北京林业大学林学院北京 100083;北京林业大学林学院北京100083;北京林业大学林学院北京 100083;北京林业大学林学院北京 100083【正文语种】中文【中图分类】S154.2【相关文献】1.解磷细菌对巨尾桉根际土壤酸性磷酸酶活性的影响 [J], 崔邢;张亮;林勇明;吴承祯;谢安强;陈灿;李键;洪滔2.野生大麦对土壤磷吸收及其酸性磷酸酶活性的基因型差异 [J], 徐静;张锡洲;李廷轩;陈光登3.管理模式对胶园土壤酸性磷酸酶活性动态的影响 [J], 陈永川;杨春霞;黎小清;李春丽;汤利4.不同绿肥翻压量及施肥条件下土壤酸性磷酸酶活性的变化 [J], 赵书军;秦兴成;张新然;侣国涵;徐祥玉;袁家富5.缓冲液种类对土壤酸性磷酸酶活性的影响 [J], 唐晓倩;耿玉清;陈艳鑫;郜少敏;杨雨果因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
【农学课件】土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、。
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货号：MS2900 规格：100管/96样土壤酸性磷酸酶（Solid-acid phosphatase，S-ACP）活性测定试剂盒
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。
测定原理：
酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
用前加100mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体×1瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。
临用前加576 μL无水乙醇（自备），24 μL蒸馏水充分溶解。
（变褐色后不能再使用）
标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：
称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4 mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。
8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。
测定步骤：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。
2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。
3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。
4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
S-ACP活性计算公式：
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活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放1μmol酚为1个酶活单位。
S-ACP（μmol/d /g 土样）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总
÷W÷T ÷1000
=0.725×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷W
C标准液：0.5 μmol/mL； V总：催化体系总体积，1.45mL；W：土壤样品质量，g；T：催化反应时间，24h=1 d。
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