花青素的分离提纯测定实验具体方案.

花青素的提取、测定

仪器材料试剂：

仪器：旋转蒸发仪，真空泵，分光光度计，真空干燥箱，水浴锅，天平材料：新鲜的紫葡萄和青葡萄

试剂：无水乙醇，盐酸，铁氰化钾，三氯乙酸，硫酸亚铁

实验步骤

一、花青素的提取：

1、挑选新鲜的紫葡萄薄洗净晾干，分离出果肉、果皮、籽粒

2、将分离晾干的紫色葡萄果皮，80℃下干燥1h。

3、称取2g磨成粉末

4、用含有1%盐酸的乙醇溶液浸提2次，合并提取液

5、讲合并提取液进行抽滤

6、60℃减压浓缩

7、真空干燥

8、得粗提取液

2、提取条件的优化：

p 水平A提取

温度 /℃

B乙醇

浓度/%

C提取时

间/min

D料液比/

（g/ml）

p 1 50 50 60 1:10 p 2 60 60 90 1:20 p 3 70 70 120 1:30

A B C D 结果

实验序

号

1 1 1 1 1

2 1 2 2 2

3 1 3 3 3

4 2 1 2 3

5 2 2 3 1

6 2 3 1 2

7 3 1 3 2

8 3 2 1 3

9 3 3 2 1

K1

K2

K3

Q

确定最佳提取方案然后对果皮、果肉、籽粒进行提取，测定最佳提取部位。

3、纯化

纸层析法提纯

1.取准备好的滤纸条（2×20cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方折叠出一条直线，作为画滤液细线的基准线。

2．用毛细吸管沾少许滤液在折线上描绘4~5次，注意要画得匀、直、细，每次画完细线要等其自然变干后再画第二根线。

3．在大试管中加入常用的展开剂有V(丁醇∶V(乙酸∶V(水=4∶1∶5,V(正丁

醇∶V(2mol/LHCl=1∶1,V(乙酸∶V(浓HCl∶V(水=15∶3∶82,1%盐酸,V(浓

HCl∶V(水=3∶97等（即层析液）。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。

4.展开后剪下色斑,以酸化甲(乙醇洗涤、浓缩,即可得到样品。

四、花青素的测定

1.采用普鲁士蓝法测定花青素的还原能力。

取一定浓度的样品溶液1 mL，加入磷酸盐缓冲液和1%K3Fe（CN）6各2.5 mL，混合均匀，混合液50 ℃保温20 min，快速冷却，加入10 %的三氯乙酸溶液2.5 mL，离心10 min。取上清液2.5 mL，加入等量蒸馏水和0.1%的FeCl3 1mL，摇匀，10min后700nm下测定吸光值A700，以抗坏血酸为对照。

2青素清除体外自由基能力测定。

利用Fenton 反应产生羟自由基[6]。取2 mL PBS（磷酸盐缓冲液pH=7.4），依次加入20mmol/L EDTA和12mmol/L FeSO4混合溶液0.1mL，一定浓度的花青素溶液1 mL、100mmol/L H2O2 0.1mL，用磷酸盐缓冲液定容至5 mL，迅速混匀，置于37 ℃水浴15 min。测定510nm 下光吸收值，计算清除率。清除率=（对照吸光度-样品吸光度）/对照吸光度×100%。