微生物ppt

• 随着微生物群落序列数据呈指数增长，样 本的元信息（寄主临床信息、DNA提取、 测序等详细信息）在数据库比对中尤为重 要。 the Genomic Standards Consortium 最近引入了一套元信息的描述标准，如： (x)序列的最小信息，这套标准已经被 the Human Microbiome Project， the Earth Microbiome Project所接受。
六.结论与展望
• 为了阐明基因、微生物、人体生理或疾病 状态之间的关系，人体微生物研究需要大 量与人类共生的微生物样本。 • 随着研究模型分辨率的提高，今后许多普 遍的微生物只需要几个基因就可以揭示， 而对于特殊微生物则需要更深入的分析。 这种高灵敏度微生物检测技术，能用于多 个方面，比如分析多个条件致病菌，了解 这些细菌在侵入机体，引发疾病之前，位 于机体的哪个位置。
人体微生物组学 研究的实验和分析工具
主要内容
人体微生物 综述目的及意义
分子生物学一般研究策略 人体微生物的研究方法
人体微生物
• 人体内有两个基因组，一个是从父母那里遗传 来的人基因组，编码大约2.5万个基因；另一 个则是出生以后才进入人体、特别是肠道内的 多达1000多种的共生微生物，其遗传信息的总 和叫“微生物组”。 • 人体微生物与人体有着密不可分的联系。人体 与其菌群之间进行着活跃的代谢交换以及 “co-metabolism”过程，因此在人体病理学 等研究中，必须考虑人体微生物群体的组成及 其行为对宿主的影响。
• 为了弥补短读取带来的限制，Illumina 测序 平台推出了末端配对测序，读取长度为 76,101,或125个碱基。但也导致了重复读 取和总片段长度增加或是中间序列缺口。 • 454焦磷酸测序技术使得更大规模的测序成 为可能，它实现了样品每百万个读取及每 数千次运行，降低每个样品的成本。但同 时也需要越来越高水平的自动化样品制备 和数据处理软件。
三.生物样品的处理及DNA的提取 1.样品采集，这是与人类相关微生物研究的 限制步骤，具有争议。它需要人类研究机 构的批准以及志愿者的同意，要求抽样过 程尽量降低感染几率，同时采取微创刮取 法（如胃、肠道的取样）。 2.DNA提取，基本步骤有细胞溶解、去除非 核酸的大分子物质以及DNA收集。细胞溶 解步骤值得注意，溶解的强度可能导致结 果偏向特定的分类群体。复杂微生物的溶 解可借助多种方法或是采用有效的试剂盒。
聚类方法有： • de novo OTU picking • reference-based OTU clustering 这两种方法相似，但reference-based OTU clustering的优点是能联合不同16S rDNA基因 的不同区域以及将不同测序方法得到的序列进 行分类。同时，将序列进行OTU分类操作能 减少嵌合序列以及错误序列。 • 可参考数据库有： VAMPS, MG-RAST，the QIIME database 等。
综述主要内容及意义
主要内容 主要叙述以DNA为基础的分子学研究方法。
目的 在微生物研究的实验设计和分析工具的使用 以及当实验者进行研究调查时涉及到微生物方 面时可以提供指导。 正如人类基因组测序能帮助我们分析个体基 因如何保护，或者干扰机体一样，人体微生物 组的研究也能用于解析人类健康的风险。
人体微生物分析流程
• 随着靶基因的研究，对于宏基因组数据的 研究一大障碍是不能在群体中识别那些不 同的显著特征，但随着各种技术的发展， 通过对在基因水平差异的统计来推测代谢 途径的不同来区分显著特征。 • 目前我们对人体微生物的认识还十分浅显。 在今后的研究中，用于参考比对基因组的 大量积累以及使用共组装的方式从短读取 中构建新的基因组是加快人体微生物研究 的关键。
3.错误率 错误率会影响到下游数据分析，可能会影 响物种的丰度，或是新物种的误断， 错误率来 源分为几种： • 微生物基因组的片段可能只被读取一次而随机 产生的错误。 • 基于PCR的嵌合序列的产生。 一般来说高错误率的序列会首先被滤除， 评价的参数有：测序的平均质量得分、均聚物 的数量和长度、引物的不匹配数量等。
研究方法
• 微生物研究的方法越来越多样化，这些方 法包括微生物识别（区系调查）、与人类 相关的微生物群落分析以及微生物相关的 基因方法（如宏基因组学）。 • 同时也对RNAs、蛋白质和代谢物质等进行 研究，这些也可以为人体微生物学研究提 供具有参考价值的数据，尤其是将它们与 区系调查和宏基因组数据进行结合分析。
1.通用PCR引物的选择 PCR引物的设定应该考虑以下因素： • 生物分类学覆盖的需要 • 扩增片段产生的系统发育信息的长度 • 测序平台对片段长度的兼容性 • 与宿主序列相比，微生物扩增序列的特异 性程度 • 根据分析的需要，使特定区域中分类学上 的和系统发育上的信息都要得到反应，如 16S rDNA中V6可变区对于全长序列的分类 地位反应较低。
• 使用下一代测序方法使得测序的数据量增加 到每个样品数亿个碱基，但它的限制在于这 些数据只有小部分的短读取片段可以被拼接 成长片段，然而这些长片段大多数也小于 2Kb. • 更深层次的问题在于这些数据中占优势的不 是微生物序列，而是包含了大量的宿主DNA. 如：人粘膜部位样品中可以包含超过80%的 人DNA。
• 目前使用的宏基因组研究方法包括通过短 距离的复合读取来增加读取长度、重叠末 端配对序列或是长读取和短读取结合的混 合方法。 • 尽管Tb级单位的宏基因组在不久的将来会 广泛使用，但宏基因组序列组装的问题不 是仅仅通过日益增加的测序深度和覆盖面 可以解决的。真正的提高依赖于测序原理 和数据质量的提高以及新测序技划分
多样性分析及 分类地位鉴定
DNA提取及测 序
距离矩阵的计 算
系统进化树的 构建
序列质量控制
序列比对
群落结构的分 析
一 以DNA为基础的微生物研究
DNA为基础的微生物研究通常分为两类。 1.特异性扩增方法，其研究集中在一个或少 数几个标记基因，并使用这些标记基因揭 示微生物的组成和多样性。这种方法优势 在于提高了微生物群落中特异性的分辨率。 2. 宏基因组策略，由于获得的基因组序列是 随机的，有时也会被称为鸟枪宏基因组学， 能在微生物群落中具有潜在功能方面研究 提供更为丰富的数据，但分辨率较低。
五.生物信息数据分析工具 经过DNA测序后大量的数据需要分析和解读， 不同的的扩增方法其分析工具也不尽相同。 1.特异性扩增数据的分析工具，使用QIIME, mothur、VAMPS 等工具与大量DNA序列数据 进行比对。但高通量测序会带来较大的错误率， 可使用AmpliconNoise 、Denoiser等工具进行 降噪处理。 2.将扩增序列分类到操作分类单位（OTU），这 是从序列推测物种的关键步骤。 OTU是把达 到或超过给定分类水平上的序列相似性阈值的 序列归位一类的分类方法。
• 人体微生物学的重要性日益凸显，用来识别和 分析微生物群落组成技术的新进展很大程度上 提高了我们对微生物群落以及它们不同生活环 境的认识，包括人类。 • 在过去的2年中，人体微生物的研究已经开始 如：Human Microbiome Project 和MetaHIT， 这些研究获得了大量的临床数据，并使用先进 的算法，联系微生物特征与临床状态，以期探 明微生物与人体生理状态之间的联系。
5.宏基因组序列的功能注释
微生物潜在功能可以通过比对大型的新 陈代谢注释库来进行分析。 the Genomic Standards Consortium 最近在制定一项比 对方法的标准。考虑到用户的需要及计算 机资源，功能注释方法可以下载并能在本 地进行操作，或是通过特殊工具将序列数 据上传到服务器进行在线比对，分析工具 如MG-RAST, CAMERA或 IMG/M 。
3.推断系统发育关系 DNA序列的系统发育关系可以通过数据库比 对或软件计算推断，如： 参考公共数据库， greengenes 或 SILVA 数据推断， NAST和FastTree 系统发育分析：UniFrac 和 Phylogenetic Diversity context of QIIME, mothur 或者其他方法。 传统的方法还可以用主坐标分析法将微生物之 间的联系可视化。或是使用rarefaction curves 显示群落内的多样性。
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4.宏基因组数据分析工具
宏基因组方法的优点在于能产生与潜在功 能如代谢性质、群落动态相关的编码序列。 • 为了确定微生物群落之间的分类关系，可以用 一些免费软件包进行分析，如使用BLAST或 interpolated Markov models进行最佳身份的 匹配，然后确定最可能的起源序列。 • 另一种方法是从宏基因读取中找到并提取系统 发育标记，然而物种中缺乏代表性的测序基因 组，不能对任意的宏基因组片段进行分类操作。 可将16S rDNA分析以及大型的参考数据库作 为补充。
引物选择对目标基因扩增测序的影响
2.真核生物及病毒的扩增
• 利用高通量分析与人体相关的真核生物和 寄生生物是非常有限的，并且难以避免宿 主基因的扩增。可能的解决这一问题的方 案是通用引物和阻碍寄主序列扩增探针的 联合使用。 • 在人体微生物中，病毒是不可忽视的。多 数病毒普遍缺乏一个基因，对病毒基因的 完整扩增结果不能作为描述病毒特征的依 据。可以使用特定分支的病毒基因来识别 病毒的亚型。
3. 减少污染 • 防止外源污染，戴手套，尽量在无菌环境 中操作并保证仪器的清洁。使用提取试剂 盒可减少污染几率。 • 样品的存放时间也有一定影响，样品长期 储存的影响还没有详尽研究，所以样本采 集后最好尽快处理。
四.DNA的测序方法
人体微生物的研究多使用16S rDNA为基础 的分类分析以及鸟枪法宏基组分析，其中测序 方法有多种： • capillary (Sanger) sequencing (such as the Applied Biosystems 3730xl DNA analyser) • 焦磷酸测序(such as the Roche 454 Genome Sequencer GS, FLX and FLX Titanium) • Illumina’s 克隆序列(such as the Illumina GAIIx and HiSeq2000).