质粒DNA限制性酶切图谱分析
高考生物一轮复习 第34讲 基因工程教师备用题库(含解析)-人教版高三全册生物试题
基因工程1.如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述,正确的是( )A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异答案 D ②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;③侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到④的染色体上,B错误;④的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。
2.(2016课标全国Ⅲ,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)图(b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。
这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是。
图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。
答案(1)Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案可酌情给分) (3)E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(其他合理答案可酌情给分)解析(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的粘性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。
质粒DNA的限制性酶切鉴定
【实验目的】 实验目的】 学习通过限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的 基本工具。限制酶特异性地结合于一段被 称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内 称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内 或其附近的特异位点上，并在此切割双链 DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其 DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其 识别位点长度为4 识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重 复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些 产生带平端的DNA片段，而另一些产生带 产生带平端的DNA片段，而另一些产生带 有粘性末端的DNA。 有粘性末端的DNA。
2、将反应物置于37℃水浴，温浴1～3小 、将反应物置于37℃水浴，温浴1 时。 3、加入5 l加样缓冲液，混匀后即可加样 、加入5 进行电泳。 4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。
【思考题】 思考题】 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的 反应效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？
pUC18/19酶切位点的分布示意图
【实验仪器与试剂】 实验仪器与试剂】 一、实验仪器 1、微量移液器 2、离心机 3、恒温水浴箱 二、试剂 1、Pst-I Pst2、ddH2O
【实验步骤】 实验步骤】 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 DW 10×Buffer 10× 质粒DNA 质粒DNA Pst-I Pst总计 体积（ 体积（l） 7 2 10 1 20
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
质粒DNA限制性酶切图谱分析
问题二：DNA切割不完全
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ 注意事项——限制性内切酶酶切 ２小时即可，充分酶解。
注意事项——DNA凝胶电泳
琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
对 策
六、限制性内切酶酶切常见问题分析
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
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平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。
【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。
特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。
限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。
内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。
细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。
历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。
每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。
同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。
表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。
表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。
2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。
质粒DNA限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6. 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动, 在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml, 用铝箔或黑纸包裹容器, 储于室温即可。
二、 材料
λDNA: 购买或自行提取纯化；
重组pUC19质粒；
EcoRI酶及其酶切缓冲液；
HindⅢ酶及其酶切缓冲液；
二、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带, 用于以后的克隆操作。
质粒DNA限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定
作者：未知 来源：生物秀 时间：2006-9-7
目的要求
（1）了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理。
（2）掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术。
实验原理
一、DNA的限制性内切酶酶切分析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
质粒后续各项检测指标
质粒后续各项检测指标一、质粒检测的重要性质粒是一种环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等微生物中。
质粒具有自主复制和传递遗传信息的能力，因此在基因工程和分子生物学研究中被广泛应用。
在质粒应用前，必须对其进行各项检测指标的检测，以确保其质量和功能的完整性。
本文将从质粒含量、质粒完整性、质粒拷贝数以及质粒菌的筛选与鉴定等方面，进行全面、详细、完整且深入的探讨。
二、质粒含量的测定方法2.1 吸光度测定利用分光光度计，通过测量DNA在260nm波长下吸光度来估算质粒的含量。
吸光度测定是最常用的质粒含量测定方法，简便快捷，但只能提供DNA的大致含量，不能得到准确的质粒浓度。
2.2 脆性凝胶电泳脆性凝胶电泳是通过比较待测质粒与已知浓度DNA的带状图像的相对亮度，来估算质粒的含量。
该方法对质粒的线性范围较窄，对低浓度质粒的测定较不敏感。
2.3 荧光法利用DNA结合染料如PicoGreen或SYBR Green I等，结合荧光探测器来测定质粒的含量。
该方法对于高浓度质粒和低浓度质粒都有较好的线性检测范围，但需要专门的仪器和试剂。
三、质粒完整性的检测3.1 琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳可以直接观察到DNA断裂或降解的情况，从而判断质粒的完整性。
完整的质粒在凝胶上会显示为一个清晰的带状条带，而断裂或降解的质粒则呈现为模糊或多个条带。
3.2 PCR检测利用引物和DNA聚合酶，进行PCR扩增，可以检测质粒的完整性。
完整的质粒能够成功扩增出目标片段，而断裂或降解的质粒则不能。
3.3 限制性内切酶切割利用特定的限制性内切酶对质粒进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳观察产生的酶切产物，可以判断质粒的完整性。
完整的质粒可以产生预期大小的酶切产物，而断裂或降解的质粒则无法或产生异常的酶切产物。
3.4 电泳迁移将不同完整性的质粒分别进行琼脂糖凝胶电泳，观察迁移的速度和距离。
完整的质粒迁移较慢，而断裂或降解的质粒迁移较快。
四、质粒拷贝数的测定方法4.1 实时荧光定量PCR利用特定引物和荧光探针，结合荧光定量PCR仪，可以定量测定质粒拷贝数。
实验三、质粒DNA的酶切
• DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限 制性内切酶的活性： 1、DNA纯度，在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制 备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金 属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。 2、核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切限制酶的标准缓冲液 包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏 糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均有可 发挥活性的一种缓冲液。 不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓 冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐 缓冲液。 在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用 良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不 同，可采用以下两种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液 的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高 盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉 淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。
注意事项： 1．酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分 会干扰酶反应。 2．进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37℃)进行，最好 使用每一种酶的专用缓冲液。当要用两种或两种以上限制酶切 割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶 可同时切割，如遇双酶酶切，应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲 液，或一种酶切结束后加TE至400μl，再进行酚/氯仿抽提、乙 醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。 3．限制性内切酶一定要低温下贮存(－20℃)，以防止酶活性降低。 4．进行大量酶切时，先要确定限制性内切酶的浓度。一般1U 限制 性内切酶于37℃条件下作用底物DNA 1h以上可切割1μg λDNA。 一般来说，要用2-3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如 此。市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先 用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的 甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否 则，酶活性将受影响。
ｄｎａ的限制性酶切反应
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
p C A M B IA 1 3 0 2
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
大p肠BR杆3菌22复or制i 起始位点
pVS1-REP 农杆菌复制起始位点
二、限制性内切酶
1) 概念 2) 命名原则 3) 类型 4) 基本特性及用途 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
实验原理
• 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为 限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附 近的特异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT ATC CTA TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
属名
种名 株系
Haemophilus influenzae d
流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核割特性、催化条件及是否具有修饰酶活 性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4) 基本特性及用途
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切 方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复 顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切 酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。
［实验原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。
细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。
它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。
由于细胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。
所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。
目前已发现的限制性内切酶有数百种。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列的切口是：EcoRⅠ: G↓AATTCHind Ⅲ: A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
［实验器材］1.仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（100mL 或50mL），玻璃纸，一次性塑料手套。
pUC19（市售和自提），EcoRⅠ酶，λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。
2.试剂（1）TAE缓冲液（1×TAE）：称取Tris 4.9g、EDTA-Na2－2H2O0.74g，用900ml蒸馏水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最终用蒸馏水定容至1L。
质粒DNA提取与限制性内切酶酶切鉴定
为了检验大肠杆菌质粒是否有目的基因，我们先要用碱法提取出高纯度的大肠杆菌质粒DNA并且进行限制性核酸内切酶酶切，然后，我们要进行酶切产物的电泳以及紫外线分光光度法检测DNA。目前这些技术已经广泛应用于基因克隆技术的检验克隆产物阶段。
二、实验原理
(1)首先利用质粒DNA和染色体DNA分子量的差异来进行的。质粒小，为双链、闭环的超螺旋DNA分子，复性容易，而染色体DNA大，不易复性，导致这两种DNA提取不同的方法。因而利用碱法提取质粒DNA，先从混合物中分离出来，然后逐步纯化即可得。
三、实验基本流程
第一部分
1、将1.5ml大肠杆菌培养液加于EP管，然后以12000rpm×60s离心；
2、弃上清，再重复一次；
3、加入150ul溶液I，充分重悬；
4、加入200ul溶液II，立即、轻柔振荡数次；
5、加入150μl冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min后以12000rpm×10min离心；
4、酶切时加入的DNA溶液体积不能太大，防止DNA溶液中其它成分会干扰酶反应。
5、在紫外分光光度调零的时候，要先选定波长260nm（样品中RNA浓度）或280nm（样品中DNA浓度）。若数值一直在波动，则表明仪器不稳定，应该立即停止使用。
五、实验结果
1、在质粒酶切电泳中，1孔Marker出现多条带状；2孔已酶切质粒出现双条带状，但是短条带比长条带更明显；而3孔未酶切质粒只有一条带状，并且长度介于已酶切质粒两个条带之间。
-
10-
1-质粒DNA酶切较完全；2-有一部分质粒DNA被酶切了，而有另一部分无；3-质粒DNA被酶切了，但是另一部分太少，所以显现清楚；4-未酶切的质粒DNA。
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
2.实验二-质粒DNA的限制性内切酶酶切
取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 10μL 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： dsDNA浓度
实验组 Buffer EcolⅠ Ⅰ Hind Ⅲ 质粒 ddH2O 总体积 4 3 3 X 10-X 20
是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切
一 实验目的
了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA
二 实验原理
型酶识别的DNA序列一般含有4 个核苷酸。 DNA序列一般含有 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端； 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 DNA同时切割产生平末端 DNA双链产生粘性末端 双链产生粘性末端。 型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ Mg2+激活 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列， 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口， 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 片断。 本实验采用PMD18- 质粒具有EcoRⅠ Hind的识别序列和酶切位 EcoRⅠ和 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 PMD18 点分别为 GAATTC CTTAAG 和 AAGCTT TTCGAA
质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳
4) 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
质粒量 缓冲液 EcoR1 Xho1
H2O 总体积
（ng） (μl)* （μl） （μl） (μl) （μl）
I 200
2
0
0 17-19 20
II 200
2
0.5
0 15-17 20
III 200
2
0.5 0.5 14-16 20
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。
置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分 别加入10l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15l进 行电泳分析。
2) 琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖， 置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE 工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该 三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3）胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶 条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一 水平位置模具上，放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小 心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速 度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整 个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10a 10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
实验五 酶切
多功能
异源三聚体 ATP、 Mg2+ 、SAM
单功能
同源三聚体 Mg2+
双功能
异源二聚体 ATP、 Mg2+
识别序列
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
切割位点
随机性切割
识别序列内或附近 特异切割 常用
应 用
不常用
数量很少，无实际 作用
4) 基本特性及用途
② DNA样品甲基化程度
限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该 DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如：
AccⅠ识别序列 能切割 AccⅠ 不能切割 T CCGG T ×CCGG AGA
6mATC
注意此处的区别
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT CTA
ATC TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
Eco RV (10442)
35S promoter UTR pUC18 MCS lacZ promoter 35S promoter
① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生 非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段 电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染 时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响 酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
（2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测
4℃ 保存备用.
三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉
试剂：琼脂糖 、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA EcoR I /HindⅢ 、
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶.
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切 割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄
主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜
体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌
(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双
质粒DNA限制性酶切图谱分析
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产 生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
一、DNA的限制性酶切实验原理
2. 限制性核酸内切酶的命名法
EB 、 加样缓冲液
四、操作步骤
1、质粒DNA的限制性酶切反应 （1）、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪
分别加入DNA 5μl， 缓冲液2μl,BSA 2ul，EcoRI 1ul， ddH2O 10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶 时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
➢ 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别 顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因 此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因 克隆。
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
（3）、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应, 置于冰箱中保存备用。
2、琼脂糖凝胶电泳 (1) 称取0.25g琼脂糖，置25ml电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解； (2)待溶液冷至60℃，加入2ul SYBR Green I。 (3)在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模 中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡； (4)凝胶完全凝固后，移去梳子和挡板，将凝胶放入电泳槽。加入 TAE缓冲液使恰好没过胶面约1mm； (5)将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中； (6)接通电源，使样品槽在负极端，用80V的电压，至溴酚蓝到胶前 沿时，停止电泳。 (7)凝胶自动处理系统（UVP）观察和拍照，记录结果。
仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
❖ 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。