蛋白质组学复习题

蛋白质组：一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质

蛋白质组学：应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能

F-2D-DIGE荧光差异显示双向凝胶电泳

在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法

具体操作步骤：

首先将待比较的两种样品提取的总蛋白分别与两种不同的荧光标记试剂（Cy2, C y3或Cy5）进行共价标记，然后将不同荧光染料标记的两种待比较的蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳，2D凝胶在成像仪上用两种不同波长激发，并将两种样品的荧光图谱显示成像，用2D分析软件进行定量分析。将显示有明显差异的蛋白点切下后进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质

PF-2D:以蛋白质组或复杂的蛋白质混合物为分离对象，通过一维色谱聚焦（即将复杂蛋白质混合物按蛋白质的等电点差异进行分离）和二维无孔硅胶反相HPLC分离色谱（即按蛋白质的疏水性差异进行分离）模式进行分级分离，软件将液相色谱的分离图转换为双向电泳形式，一维为等电聚焦结果，二维为分子量分离结果，为蛋白质组学研究提供了一个创新的技术平台。

从头测序（Do novo sequencing）:不使用来自蛋白质数据库的信息，直接解释串联质谱数据的方法和技术

通过20种氨基酸残基的质量等信息以及主要类型离子谱峰间的质荷比（M/Z）差值来构造序列。这类蛋白质鉴定方法就称为蛋白质的从头测序。

Tandem mass spectrometry串联质谱:由2台质谱仪经1个碰撞室串联而成。首先利用第一台质谱仪选择特殊离子，在进入第二台质谱仪之前，先进入碰撞室与加入其中的气体（氮气或氦气）产生碰撞形成各种离子，再利用第二台质谱仪依各离子的质核比不同而分离，形成第二次质谱，可作为离子结构判断的依据

肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprint）PMF:指特定的蛋白酶对蛋白质进行酶解后的质谱分析得到一套多肽质量图谱，这种特性就象指纹一样，每种蛋白都具有特定的质量肽谱。碰撞诱导解离（CID）:在三级四级杆质谱中，第一级Q1和第三级Q3四级杆是质量过滤器，第二级四级杆Q2仅施加射频电压，充当产生碎片离子的碰撞室，从Q1传送来的肽离子在碰撞室内经惰性气体如Ar和N2的碰撞诱导产生正离子，这一过程称为碰撞诱导解离

肽序列标签(Peptide sequence tag, PST)技术 蛋白质由20种氨基酸组成，5～6个氨基酸残基的序列片段在一个蛋白质组成中具有很高的特异性,这个片段称为PST，可用于蛋白质鉴定。源后衰变(PSD):母离子在源内离子化后，在飞行过程中会产生一系列的亚稳离子，恰这些离子主要是沿多肽骨架断裂形成，产生的这些碎片离子在理论上包含着这一肽段的氨基酸序列信息。由于这一过程发生在源内离子化之后，所以称为源后衰变。

蛋白质芯片:通过微加工和微电子技术对固相载体进行特殊的化学处理，将大量已知的蛋白质如抗原、抗体、受体、配体等有序的固定在载体上，使其与待检蛋白质分子进行特异性结合或反应，经洗涤和检测信号的强弱判断样品中的靶分子数量和特征，从而实现对蛋白质组分的准确、快速和大信息量的筛检。

蛋白质组样品的全息制备: 就是要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物理化学特性不同等，要达到真正的全息制备是有难度的.

蛋白质组学的主要技术，简述它们的基本原理

双向电泳质谱酵母双杂交噬菌体显示技术蛋白质芯片技术荧光差异显示双向电泳同位素亲和标签生物信息学色谱-质谱联用Edman 降解法

13、蛋白质样品制备过程中应着重注意哪几方面？

1 应保持蛋白质的最大溶解度和可重复性；

2 选择合适的表面活性剂和还原剂；

3 去除干扰分子和污染；

4 防止蛋白质在处理过程中的修饰，使用低温条件制备；

5 裂解液应新鲜制备；

6 样品应保持新鲜

14、双向电泳分析中的样品制备原则？

1 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性

2 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀

3 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。

4 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白

5 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性

双向电泳的主要原理、关键步骤、缺陷与面临的挑战以及其衍生技术DIGE的主要原理

主要原理

双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，它是按蛋白质分子量的大小进行分离。2-DE最大的应用是能分离相同分子量的同分异构体以及经过翻译后修饰的蛋白质，蛋白质经过诸如磷酸化后，其电荷数量发生改变。通常蛋白质的磷酸化形式可以与未磷酸化的对应物分离开，在双向电泳胶上出现一串水平斑点。

关键步骤

2-DE胶作为一种平行的分离技术，其局限性最值得关注的是对低丰度蛋白，极疏水蛋白和极碱性蛋白的无能为力。实验的重复性仍然是个很大的问题。

细胞膜和骨架蛋白质的回收率不稳定，一些蛋白质可能完全被提取，而仍然有高达10%的蛋白质在提取后残留在沉淀颗粒中。

目前还没有一种万能的染色方法，能使胶上的所有蛋白质都被染上或检测到。而且，现在已经逐渐明确了很多均匀的蛋白点还包含有两个以上的蛋白质。

在早期的MALDI-TOF技术中应用了哪两项技术来提高质谱仪的分辨率，它们的主要原理是什么？Delayed extraction or Time lagged focusing (时间延迟提取或时间延迟聚焦)Reflection(反射模式)

6.固相PH梯度双向电泳比传统的2D电泳有哪些优势？

利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定的，不随环境变化的的PH梯度.使用固相PH梯度等电聚焦作为第一向，不但可以检测碱性蛋白，并且可以得到整个PH范围的双向图谱。PH范围可以在2.5-11，所以几乎在一张双向电泳图谱上可以得到整个细胞产物的分离点。分辨率也比传统的等电聚焦要更高，可达0.001PH，是目前分辨率最高的电泳方法。

7、基质辅助激光解吸/电离与电喷雾电离的主要原理是什么？

MALDI样品与基质混合后送入金属片（靶）上，溶剂在空气中挥发后，形成样品-基质共结