酶工程-酶的固定化
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。
这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
酶工程 固定化酶(3.1.1)--固定化酶概述
3 ． pH 的变化 - 影响酶活的机理
• （ 1 ） 改变酶的空间构象 • （ 2 ）影响酶的催化基团的解离 • （ 3 ）影响酶的结合基团的解离 • （ 4 ）改变底物的解离状态，酶与底物不
能结合或结合后不能生成产物。
固定化酶（细胞）对 pH 稳定性变化
固定化酶 pH 的变化
• 1 ） 载体带负电荷，最适 pH 向碱性方向移 动。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半
3. 评价固定化酶的指标：
• 3.
• 4.
或称偶联效率，活力保留百分数。 • 5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或 RNA ）量的固定
化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第三节 固定化酶的制备 • 一． 一般方法及特点 • 二． 酶的固定化方法
第一节 概述 二 固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
1953 年， Grubhofev 和 Schleith 首先开 始了 酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定 化。
2 、固定化后的空间障碍效应的影响。 3 、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
阻 4 、包埋法时高分子物质进入半透膜较困难
2. 固定化后酶性质的变化
酶工程 固定化酶(3.2.1)--固定化辅酶
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结 构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与 功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大 分子结合法。 常 用 的 水 溶 性 大 分 子 修 饰 剂
聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物 (Ficoll) 、葡 聚糖、环糊精、肝素、羟甲基纤维素、聚氨基酸、 乙烯酮、
酶分子修饰的意义
• 提高酶的活力 activity • 增强酶的稳定性 stability • 降低或消除酶的抗原性 immu 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、
金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的 影响 structure
酶分子修饰的基本要求和条件
三、辅酶固定化
• 1 原因
• 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应 ( 递氢、递电子或递某些化学基团的作用）
• 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 • 有机辅因子价格昂贵
• —— 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和
再生
辅酶固定化的方法：
• 2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及 重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在 超滤器中。
• 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以 恢复或者部分恢复。
• 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不 同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有 的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶 经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯 度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶 液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四 乙酸（ EDTA ）等，使酶分子中的金属离子 与 EDTA 等形成螯合物。通过透析、超滤、 分子筛层析等方法，将 EDTA- 金属螯合物从 酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
酶六章酶的固定化
迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。
酶的固定化
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
酶的固定化技术及其应用综述
酶的固定化技术及其应用曾鸿雁(西南科技大学,四川,绵阳)摘要:随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶在各个领域的广泛应用，对酶的要求也越来越严格。
本文针对目前酶工程技术之一酶的固定化，对酶的固定化技术及其展望做一综述。
关键词：酶，固定化，技术Immobilization of Enzyme And its Applications Abstract：with the continuous development of biotechnology industrial and enzyme engineering , enzyme are widely used in various fields and the requirements to enzymes also become more and more stringent . This article is to review the enzyme immobilization, which is one of the current enzyme engineering technologiesKey words: enzyme, immobilization, technology一、引言酶是一类具有生物催化性质的高分子物质，其催化性具有专一性强、催化效率高和作用脚尖温和等特点。
但是在实际工业生产中，由于实际环境因素，应用酶的过程出现了一些不足之处：①酶的催化效率不高。
人们在使用酶的过程中，往往要求酶的催化效率要足够高，以加快反应速度，提高劳动生产率，然而实际上很多酶的催化效率不够高而难于满足人们的使用要求。
②酶的稳定性较差。
大多数酶稳定性较差，在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变形失活。
③酶的一次性使用。
酶一般是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混合在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。
酶工程制药—固定化酶的应用
2、固定化酶在医学上的应用作为治疗药物 固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。 人工肾： 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性 炭组成人工肾。 3、固定化酶在酶传感器方面的应用 最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反 应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。
（3）高果糖浆的生产-葡萄糖异构酶 葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一 种固定化酶。 （4）β-半乳糖苷酶 又称为乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖， 生成半乳糖和葡萄糖用于制造低乳糖奶。 已于1977年实现工业化
（5）延胡索酸酶 生产L-苹果酸;天冬氨酸酶用于延胡索酸转化生产L-天冬氨酸。 （6）脂肪酶 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的 脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。已经有多种 固定化脂肪酶用于工业化生产
固定化酶的应用
1、固定化酶在工业生产中的应用 （1）氨基酰化酶 世界上第一种工业化生产的固定化酶。 1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶. （2）植酸酶 植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。 固定化植酸酶已经工业化生产，广泛用于饲料行业。
课堂总结
固定化酶的应用
固定化酶的应用
引入
固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游 离细胞定位于限定的空间区域内， 使其保持活性并可反复利用。
模块三、酶的下游生产工艺
学习情境十四
酶的固定化
工作任务 （一） 固定化技术和固定化酶概述
酶工程 第六章 酶的固定化 (2)
13
2、影响固定化酶性质的因素
（2）载体的因素
• 空间效应：
构象效应：由于酶与载体间的共价键作用，引
起酶活性部位发生扭曲和变形，改变活性部位
的三维结构，导致酶活力下降。
位阻效应：载体结构上的某些不良特征致使酶
18
载体内部固定化酶的传质过程
• 步骤1：底物从液相主体穿过液膜扩散到 载体（胶囊）的外表面 • 步骤 2：底物穿过胶囊微孔，进入胶囊内 部，与酶分子接触 • 步骤 3：底物在胶囊内被酶分子催化发生 反应，生成产物 • 步骤 4：产物穿过胶囊微孔，排出胶囊 • 步骤 5：产物穿过液膜，从胶囊外表面扩 散进入液相主体 • 存在外扩散阻碍和内扩散阻碍
49
• 生物传感器的应用
50
• 例：葡萄糖氧化酶电极
用的酶膜，再 与氧电极及聚四氟乙烯高分子薄膜紧 密结合，组成葡萄糖氧化酶电极
使用时，使酶电极进入样品溶液中，
样品中的葡萄糖扩散到酶膜中，在氧 气的存在下被酶催化氧化生成葡萄糖 酸，根据氧电极测得的氧浓度的变化， 可得知葡萄糖的浓度
41
1、固定化酶在工业生产中的应用
（2）固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆
耐热性淀粉酶 糖化酶 葡萄糖异构酶
淀粉
pH6.0~6.5 96~100℃ 30min
糊精
葡萄糖
pH3.8~4.5 60℃ 48~72h pH7.8~8.2 61℃
果葡糖浆
含果糖42％，葡萄糖52％
•生产果葡糖浆是酶工程在工业生产中最成功、规模最大的应用。
3、固定化酶的性质：酶活力、稳定性、最适温度、 4、评价固定化酶的指标：固定化酶的比活、半
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
第十三章 酶固定化
烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化， 然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应， 制备固定化酶
共价结合法
特点：
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连
续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而
影响酶的催化活性。
4、交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交 联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等双功能试剂。 特点：
喷雾干燥 淀粉 淀粉酶 液化液 糖化酶 糖化液 结晶 异构酶 结晶葡萄糖 果糖42% 葡萄糖55% 低聚糖 高果糖浆 果糖浆 果糖80-90% 果糖55% 葡萄糖39% 低聚糖 氢化还原 粉状葡萄糖 山梨醇
果葡糖浆 混合
分离
天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶 β-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-β-脱羧酶 脂肪酶
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
结合法 共价键结合法 离子键结合法 制备难易 难 易 包埋 法 吸附法 交联 法
较难
易
较难
结合程度
活力回收 再生 费用 底物专一性
强
低 不能 高 可变
中等
高 可能 低 不变
强
高 不能 低 不变
弱
高， 酶易流失 可能 低 不变
强
中等 不能 中等 可变
三、固定化酶的性质 1、酶的稳定性。
第十三章 酶固定化
第一节 酶的固定化
酶的固定化方法
固定化酶的性质 固定化酶的应用
为什么要将酶固定化？
游离酶在应用中的不足
稳定性较差； 难于回收重复利用；
给后续分离纯化增加困难。
酶的固定化
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1）离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：（1）重氮化法（2）叠氮法（3）溴基化法（4）烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
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破坏或受损。 （4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高
催化效率和产物的量。 （5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反
应。 （6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。
定义：利用电离辐射引发产生自由基的能力，在 室温或低温下诱发有机单体合成生物高分子材料 来包埋酶的方法。
如辐射聚合的水凝胶包埋酶。
（2）纤维包埋法
大规模生产。 把酶溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚乙烯）的有机
溶剂（二氯甲烷）中乳化，然后通过多孔喷丝头把 上述乳化液挤压进入凝结液中，即形成丝状的纤维 包埋体，酶包埋在纤维束内。 包埋量高、包埋牢固。
载体：离子交换剂。 阴 离 子 交 换 剂 ： 二 乙 氨 基 乙 基 (DEAE)- 纤 维 素 、 混 合 胺 类 (ECTEOLA)- 纤 维 素 、 四 乙 氨 基 乙 基 (TEAE)- 纤 维 素 、 DEAE葡聚糖凝胶等； 阳 离 子 交 换 剂 ： 羧 甲 基 (CM)- 纤 维 素 、 纤 维 素 柠 檬 酸 盐 、 Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、
二氧化钛、羟基磷灰石等。 纳米材料载体：聚苯乙烯、金纳米颗粒等；比表面积
大、生物相容性好，但难于分离、易产生团聚。
（2）离子吸附法 (ion adsorption)
定义：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力 相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定 化方法。
分为： 聚丙稀酰胺凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法 辐射包埋法
海藻酸钙凝胶包埋法
E
E
E
E
1-2%海藻酸钠 +酶液
5%CaCl2溶液
使用最广、研究最多； 高 浓 度 Mg2+ 、 磷 酸 盐 、
单价金属离子破坏凝胶 的结构； 固化、成型方便； 孔隙太大，酶易泄露。
辐射包埋法
优点：操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等。 此外，吸附过程同时可以纯化酶。
缺点：酶与载体的结合不够牢固，易受环境因素 如pH、离子强度、底物浓度等影响。
（3）生物特异性吸附法
定义：依据互补生物分子间的亲和作用而将酶间 接固定在载体上，利用酶与它的抗体的特异性结 合来实现酶的固定化。
利用糖蛋白糖基实现特异吸附固定化。如凝集素。
④ 脂质体包埋法
脂质体是由人工制备的定向排列的磷脂双分子构成的封 闭囊状结构，可用于药物、酶包裹的载体。
2.3 共价结合法
共价结合法（covalent binding）:酶分子与载体 之间以共价键作用而实现结合的固定化方法称为共 价结合法。是通过酶分子表面的功能基团与载体表 面的功能基团发生化学反应形成共价键的一种固定 化方法。
2.2 包埋法
包埋法是将酶分子截留在具有特定网状结构载体 中的一种方法。
不需酶蛋白的氨基酸残基参与载体的结合；反应 条件温和，很少改变酶结构；酶活力回收率高。
分为凝胶包埋法、纤维包埋法、半透膜包埋法。
（1）凝胶包埋法
凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、 明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰 胺凝胶、聚乙烯醇和光交联树脂等。
2 固定化酶的制备方法
酶的固定化方法主要可分 为四类：吸附法、包埋法、 共价结合法和交联法。
对于特定的目标酶，要根 据酶自身的性质、应用目 的、应用环境来选择固定 化载体和方法。
在具体合部位不应当是酶的活性部位，固 定化时应采取尽可能温和的条件。
2.1 吸附法
吸附法是通过大量的氢键、疏水作用、离子键等 非共价相互作用，将酶固定于水不溶载体表面的 固定化方法，是酶固定化最简单的方法。
吸附法又可分为物理吸附法、离子吸附法和生物 特异性吸附法。
（1）物理吸附法(physical adsorption)
定义：通过物理方法将酶直接吸附在载体表面上而使酶固定 化的方法。酶与载体的亲和力主要是范德华力、氢键、疏水 作用。
体干燥法、脂质体包埋法。
微胶囊的制备方法
① 界面沉淀法
是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的膜将酶包埋。
② 界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用疏水性单体和亲水 性单体在界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起 来。
微胶囊的制备方法
③ 液体干燥法
是将一种聚合物（乙基纤维素）溶于与水不混溶的有机 溶剂中，加入酶液，乳化剂乳化，分散于含有保护性胶 质和表面活性剂的水溶液进行二次乳化，搅拌，低温真 空出去有机溶剂即可实现酶的包埋。
（3）半透膜包埋法
是将酶包埋在各种半透性聚合物膜的微囊内，制成 固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有 几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
特点
半透膜使酶存在于类似细胞内的环境中，且可防止酶 脱落，增加了酶的稳定性；适用性底物和产物都是小 分子物质的酶；
微胶囊直径一般只有几微米至几百微米，表面积大。 物质扩散的阻力更明显。 微胶囊的制备方法有：界面沉淀法、界面聚合法、液
第四讲 固定化酶与固定化细胞
主要内容：
1 固定化酶的定义与优点 2 固定化酶的制备方法 3 固定化酶的特性 4 细胞的固定化 5 辅酶的固定化
蒸汽→
游离酶的使用
稳定性差 酶无法回收 产物分离纯 化困难
酶解罐简易图
1 固定化酶的定义与优点
采用适当的方法使酶处于一个闭锁状态，能连 续进行催化反应，反应后的酶可以回收重复使 用，这样的过程称为酶的固定化。
所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在 一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连 续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，
同时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。