动物细胞工程实验指导讲解
高二生物 动物细胞工程 知识讲解
动物细胞工程（动物克隆技术）【学习目标】1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用。
2、比较动物细胞培养与植物组织培养区别。
3、简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。
【要点梳理】要点一：动物细胞培养 1、动物细胞培养概念（1）动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。
（2）动物细胞培养过程中的几个重要概念：①细胞贴壁：培养液中分散的细胞很快贴附在瓶壁上生长繁殖，称为细胞贴壁或贴壁生长。
②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。
③原代培养：将动物的器官或组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶内，放在适宜的条件下培养，这种培养叫原代培养。
④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，还要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后，再分瓶培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。
2、动物细胞培养过程（1）取材：动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织。
（2）过程：原代培养→传代培养→细胞株→细胞系 （3）动物细胞培养过程： 要点诠释大多数死亡 原代培养动物胚胎或幼龄动物器官、组织单个细胞细胞悬浮液10代危机剪碎，胰蛋白酶、 胶原蛋白酶处理子代细胞可继续传代的细胞50代危机绝大多数死亡可无限传代的细胞（连续细胞系）有限细胞系①取自动物胚胎或幼龄动物器官、组织，是因为组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。
②胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养。
③用胰蛋白酶处理组织块，可使细胞分散开，这样做的目的是使细胞与组织液充分接触，这也说明了细胞间的主要物质是蛋白质，但是由于细胞膜的主要成分之一也是蛋白质，因此要控制好处理的时间，不能太长，否则会损伤细胞。
由于多数动物细胞培养的适宜pH 为7.2～7.4，因此不能使用胃蛋白酶分散细胞。
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的概念与发展动物细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作，以获得人们所需要的新的生物类型或细胞产品的一门综合性技术。
它的发展可以追溯到 20 世纪初，随着细胞培养技术的不断进步，动物细胞工程逐渐成为现代生物技术的重要组成部分。
从最初的简单细胞培养，到如今复杂的细胞融合、细胞核移植等技术，动物细胞工程在生物制药、医学、农业等领域都发挥着越来越重要的作用。
二、动物细胞工程的基本技术1、动物细胞培养这是动物细胞工程的基础技术。
细胞培养需要在无菌、适宜的温度、pH 值和营养条件下进行。
首先要获取动物组织或细胞，经过处理后接种到培养瓶或培养皿中，添加合适的培养基。
培养基中包含细胞生长所需的营养物质、生长因子等。
在培养过程中，要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，以保证细胞的正常生长和分裂。
2、动物细胞融合通过物理、化学或生物的方法，使两个或多个动物细胞融合成一个杂种细胞。
常用的方法有电融合法、化学融合法和病毒介导融合法。
细胞融合技术可以打破物种之间的界限，创造出新的细胞类型，为生物制药和疾病治疗提供了新的途径。
3、细胞核移植将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，使其重新发育成一个完整的个体。
细胞核移植技术在克隆动物的培育中具有重要意义，例如著名的多利羊就是通过细胞核移植技术诞生的。
4、动物细胞克隆包括胚胎细胞克隆和体细胞克隆。
胚胎细胞克隆是指将早期胚胎的细胞分离出来，进行培养和克隆。
体细胞克隆则是将成年动物的体细胞进行核移植，培育出克隆个体。
三、动物细胞工程的应用1、生物制药利用动物细胞培养技术生产各种生物制品，如疫苗、抗体、蛋白质药物等。
例如，通过培养哺乳动物细胞来生产单克隆抗体，用于疾病的诊断和治疗。
2、医学领域在器官移植方面，通过细胞工程技术可以培育出人造器官或对器官进行修复和改造。
在疾病治疗方面，细胞免疫治疗是一种新兴的治疗方法，通过改造患者自身的免疫细胞来对抗肿瘤等疾病。
高中生物课程教案分享：动物细胞培养实验案例讲解
高中生物课程教案分享：动物细胞培养实验案例讲解导言生物学是指研究生物体及其相互关系和运动规律的学科，其内涵包含了多样性、相互作用、进化和适应性等。
而生物学课程不仅是学生学习生物学或进一步攻读医学或生物科学的必要前提，更是一种较为全面的自然科学。
在生物课程的教学中，神经元和细胞、遗传学、免疫学等学科是不容忽视的重要内容之一。
在其中，细胞学更是贯穿整个课程的核心。
教学目的细胞培养实验是细胞学领域一个常见的实验技术，使用这种技术，我们可以在实验环境下研究细胞的许多功能和过程。
这一实验的教学目的包括：1.理解细胞培养的重要性和运作原理；2.学习如何准备培养基及其配制方法；3.学会样本准备和理解细胞培养的基本技能；4.掌握无菌操作和安全措施。
教学过程实验材料1.细胞培养基（DMEM）；2.无血清胎牛血清（FBS）；3.法尼迪胆红；4.表面活性剂（如Tween 20）；5.96孔板。
步骤1：样品收集洗涤细胞样品及其培养。
为保证实验能够顺利进行，必须使用无菌技术并避免感染风险。
在进行收集样品作业前，务必洗手及其消毒，并在时期内保持反复按照。
此外，需要准备完整的实验平台及其消毒设备，如消毒液、眼罩、手套、口罩等。
步骤2：试管准备收集样品后，需要将其移动至已经清洗和消毒的环境中。
此时，必须通过微生物循环柜和干燥器来消毒以及干燥工具和表面。
之后，Proceed to add the culture medium, FBS,and penicillin-streptomycin combination.在处理试管时使用无菌循环柜，紧挨着清洁过的手套将保存期点的细胞样品注入，使其均匀分布于试管中。
步骤3：细胞培养在培养过程中，需要定期观察其细胞的生长状况和替换细胞培养基。
此外，还需要为细胞提供必要的营养物质和环境因素。
在这些位置，需要进行的步骤如下：1.使用微量注射器在试管里添加保护培养基和抗生素，确保细胞的生存和稳定；2.在试管上方贴上无菌膜，不仅可以保护试管和培养基，还能增加细胞的纯度和稳定性；3.将试管在配备好了的細胞培養箱中放置，在恒温孵育器上设置适宜的温度、湿度和氧气供应，确保试管保持稳定和深度。
动物细胞工程实验
《动物细胞工程》综合设计实验一、实验目的1 了解动物细胞培养基本设备、器材、实验室设计及实验规则。
2 掌握动物细胞培养常用液体配制方法。
3 掌握细胞传代技术。
4 学习动物细胞形态观察及活性测得方法。
二、实验内容（见下具体实验）三实验报告：1完成细胞培养常用培养液配制2 完成细胞传代操作，并写出细胞传代步骤和注意事项。
3用柱状图表示MTT法测定黄花蒿植物浸出液对细胞的IC50 。
4 计数活细胞百分率。
实验1 动物细胞培养液的配制（参考细胞工程试验教程P 100）需要配制的动物细胞培养液包括：一、无血清培养基的配制二、D-hanks细胞平衡液的配制三、细胞消化液的配制四、双抗溶液的配制无血清培养基的配制（各组配制100ml）无血清培养基(RPMI-1640): 是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
大量组分：按照以上配方，称取所需量加入1000ml去离子水即可。
20种氨基酸混合溶液：已配备用，取量为1ml加入1000培养液即可。
维生素溶液：已配制成母液，各种微生物母液取量1ml加入1000培养液即可。
D-Hanks 细胞平衡液的配制（每组配制100ml）D-Hanks 溶液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液。
主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。
NaCl 160gMgSO4·7H2O 2gKCl 8gMg Cl2·6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水细胞消化液的配制（各组配制10ml）0.25%胰蛋白酶细胞消化液：称量胰蛋白酶0.25g和EDTA-Na 0.02g 溶于100ml的D-Hanks 溶液，磁力搅拌溶解后，0.22um细菌过滤器过滤除菌。
-20℃保存备用。
双抗溶液配制（已配，备用）（1）氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
(讲课)动物细胞工程课件
8、如何理解原代培养和传代培养？
上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，
之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养。
9、传代培养的细胞能一直传代下去吗？
不都能。
10、有些为何能一直传下去？
核型改变，遗传物质发生突变，丧失接触抑制 特性，突破细胞寿命极限，朝着癌细胞方向发展。
11、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？
结：
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
为什么用胰蛋白酶处理？
剪碎用胰蛋白酶处理
单个细胞 原代培养特点：细胞贴壁、 加培养液稀释 接触抑制。 细胞悬浮液 传代10代以内，遗传物质不改 原代培养 变，保持正常二倍体核型。 转入培养瓶
传代10-50代左右，增长缓慢 以至于完全停止，部分细胞核 型可能发生变化（遗传物质可 能改变）。 继续传代培养少部分细胞获得 不死性，细胞突变，遗传物质 已经改变，等同于癌细胞。
4、动物细胞的全能性和植物细胞的全能性一样吗？
不一样。
1）、高度分化的植物细胞仍然有发育成完整植株的能力，保持
着细胞全能性。细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发
育成完整新个体的潜能。 2）、高度分化的动物细胞，从整个细胞来说，它的细胞全能性 受到限制。但是，它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细 胞核内仍有保持该物种遗传特性的全套遗传物质。只不过植物 细胞的全能性更容易表达出来，而动物细胞的全能性的表达能 力不如植物细胞。因为动物细胞经过多次分裂后细胞质的成分 已经发生了改变，激发细胞全能性表达的物质已经基本消失 。 我们说，高度分化的动物细胞核具有全能性。
动物细胞工程
◆动物细胞培养 ◆动物体细胞核移植技术和克隆动物 ◆动物细胞融合 ◆单克隆抗体制备
知识回顾：
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的概念动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的操作，以获得人们所需要的生物产品或细胞本身。
它是现代生物技术的重要组成部分，涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植等多个方面。
二、动物细胞培养（一）基本原理细胞培养的基本原理是细胞的增殖。
细胞在适宜的环境中，能够吸收营养物质，进行新陈代谢，并通过分裂增加数量。
（二）培养条件1、无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还会添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。
2、营养物质：包括糖、氨基酸、无机盐、维生素等，这些物质要按照细胞所需的种类和量进行精确配置。
3、适宜的温度和 pH：哺乳动物细胞的培养温度一般在 365℃左右，pH 则在 72 74 之间。
4、气体环境：细胞培养所需的气体主要有氧气和二氧化碳，氧气用于细胞呼吸，二氧化碳则用于维持培养液的 pH。
（三）培养过程1、取材：通常从动物的组织或器官中获取细胞，如从胚胎或幼龄动物的器官组织中获取细胞，其分裂能力更强。
2、原代培养：将取得的组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，使其分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶中培养。
3、传代培养：当细胞贴满瓶壁时，需要用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱落下来，然后分瓶继续培养。
三、动物细胞融合（一）概念动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
（二）诱导融合的方法1、物理法：如电激融合法。
2、化学法：常用的诱导剂是聚乙二醇（PEG）。
3、生物法：如灭活的病毒。
（三）应用1、制备单克隆抗体：这是动物细胞融合技术最突出的应用。
2、用于基因定位和染色体转移等研究。
四、单克隆抗体（一）概念单克隆抗体是由单个 B 淋巴细胞经过无性繁殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
（二）制备过程1、给小鼠注射特定的抗原，使其发生免疫反应，产生能分泌特定抗体的 B 淋巴细胞。
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的定义和范围动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的遗传操作以及细胞和组织培养技术，以改造细胞、创造新的生物品种或生产生物产品的一门综合性科学技术。
其范围涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、细胞重组、转基因动物等多个方面。
二、动物细胞培养技术（一）基本原理细胞培养是动物细胞工程的基础，其原理是细胞具有分裂和生长的能力。
在适宜的条件下，细胞可以不断增殖并保持一定的生理特性。
（二）培养条件1、无菌环境：防止微生物污染是细胞培养成功的关键。
2、合适的培养基：包含细胞生长所需的营养物质，如氨基酸、维生素、无机盐等。
3、适宜的温度和 pH：一般来说，培养温度在 37℃左右，pH 在 72 74 之间。
4、气体环境：通常需要 95%的空气和 5%的二氧化碳，二氧化碳用于维持培养基的 pH 稳定。
（三）培养过程1、取材：从动物体内取出组织或器官，进行处理以获得单细胞。
2、原代培养：将获得的细胞直接培养，这是细胞培养的第一代。
3、传代培养：当原代培养的细胞生长到一定密度时，进行分瓶培养。
（四）应用1、生物制品的生产，如疫苗、抗体等。
2、细胞生物学和分子生物学的研究。
3、药物筛选和毒性测试。
三、细胞融合技术（一）原理细胞融合是指两个或多个细胞通过物理、化学或生物方法融合成一个杂种细胞的过程。
其原理基于细胞膜的流动性。
（二）方法1、病毒诱导融合：使用某些病毒，如仙台病毒，促使细胞膜融合。
2、化学诱导融合：常用的化学试剂有聚乙二醇（PEG）。
3、电融合：通过电场作用使细胞排列紧密接触，进而融合。
（三）应用1、单克隆抗体的制备：将免疫小鼠的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，分泌单克隆抗体。
2、细胞遗传和细胞免疫的研究。
四、细胞核移植技术（一）原理细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，使其发育成一个新的个体。
这基于细胞核的全能性，即细胞核包含了生物体发育所需的全部遗传信息。
动物细胞工程教案
动物细胞工程教案一、教学目标1. 了解动物细胞工程的基本概念和原理。
2. 掌握动物细胞培养、核移植、细胞融合等技术。
3. 能够分析动物细胞工程在生物制药、疾病治疗等领域的应用。
4. 培养学生的实验操作能力和创新思维。
二、教学内容1. 动物细胞工程的基本概念和原理动物细胞工程的定义动物细胞工程的基本步骤动物细胞工程的技术手段2. 动物细胞培养技术动物细胞培养的基本步骤动物细胞培养的条件和注意事项动物细胞培养的应用实例3. 核移植技术核移植的定义和原理核移植的方法和步骤核移植技术的应用实例4. 细胞融合技术细胞融合的定义和原理细胞融合的方法和步骤细胞融合技术的应用实例5. 动物细胞工程的应用生物制药领域的应用疾病治疗领域的应用基因编辑领域的应用三、教学方法1. 讲授法：讲解动物细胞工程的基本概念、原理和技术。
2. 实验法：进行动物细胞培养、核移植和细胞融合等实验操作。
3. 案例分析法：分析动物细胞工程在实际应用中的具体案例。
4. 小组讨论法：分组讨论动物细胞工程的技术优缺点及应用前景。
四、教学资源1. 教材：动物细胞工程相关教材或参考书籍。
2. 实验器材：显微镜、细胞培养箱、离心机等。
3. 网络资源：相关学术论文、新闻报道、视频资料等。
五、教学评价1. 课堂问答：评估学生对动物细胞工程基本概念的理解。
2. 实验报告：评估学生在实验操作中的技能和分析能力。
3. 小组讨论：评估学生的团队合作意识和创新思维能力。
4. 期末考试：评估学生对动物细胞工程知识的掌握程度。
六、教学安排1. 课时：共计32课时，其中包括16课时的理论教学和16课时的实验教学。
2. 教学计划：第1-4课时：讲解动物细胞工程的基本概念和原理。
第5-8课时：讲解动物细胞培养技术。
第9-12课时：讲解核移植技术。
第13-16课时：讲解细胞融合技术。
第17-20课时：讲解动物细胞工程的应用。
第21-24课时：进行动物细胞培养实验。
第25-28课时：进行核移植实验。
动物细胞工程实验指导讲解
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15 ;用于动物的一般是DMEM 和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA用于清洗细胞表面，螯合心32+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCI，KCI，Na2HPO4, KH2PO4, EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4C冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL ; EDTA 50 mL ;培养基90 mL （使用前加入10 mL血清）。
动物细胞工程实验
实验一机械法分离培养动物细胞及计数一.实验目的1.掌握机械法分离培养动物细胞的原理及方法2.掌握细胞计数的方法二.实验原理在机体中，器官通常由几种组织构成，组织又由细胞通过紧密连接锚定连接、通讯连接构成组织。
采用机械法破坏细胞间的连接，能获得单个细胞。
本实验采用剪碎小白鼠肝组织的方法获取单个肝细胞，该方法简单易行。
三.实验材料1.动物：小白鼠（成年）2.试剂：PBS缓冲液，RPMI-1640培养液3.器材：手术器械、试管、滤网、离心管、离心机、显微镜等；四.实验方法1.无菌获取肝组织取成年小白鼠一只，断颈处死，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精洗碘。
剪开腹壁，暴露肝脏组织，换手术器材，剪取0.3mm3肝脏组织块，置于培养皿中。
2.获取细胞剔除脂肪组织，加PBS缓冲液1ml，反复冲洗2-3次，剪碎组织块至1mm3，加RPMI-1640培养液，滤网过滤至离心管。
平衡、离心（1000rpm,5min），弃上清，加培养液1ml，吹打均匀，成细胞悬液。
3.细胞计数取细胞计数板一个，盖上盖玻片，去细胞悬液，沿盖玻片便于滴1滴，显微镜下计细胞数，原则：计上不计下，计左不计右4.细胞培养加细胞培养液，稀释至1X105个/ml，移入培养皿，37℃，CO25%培养箱中培养四.实验结果实验二酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞一.实验目的掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法二.实验原理胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之剑的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+的存在下，才能行使这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价例子，使细胞被消成单细胞状态；本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉细胞获得单个细胞。
三.实验器材1.试剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA，PBS2.器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，血球计数板，离心管等3.材料：怀孕13-17天母鼠四.实验步骤1.取材：断颈处死怀孕小鼠，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘，剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中2.剔除和清洗：从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次3.剪碎：将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3（剪15-20min）4.消化：加入4ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化5-7min5.终止：加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化6.收集细胞：离心用100目滤纱将细胞悬液过滤至离心管中，平衡离心（1000rpm,5min）7.制备细胞悬液：弃上清，加1ml1640培养液，吹打成细胞悬液8.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察9.细胞计数：按上一实验介绍方法计数10.培养细胞：将稀释至1X105个/ml细胞悬液加入培养皿中，置于5%CO2，37℃，75%湿度培养箱中培养实验三牛镜子细胞冷冻与活率检验一.实验目的1.掌握细胞冷冻解冻原理及方法2.掌握细胞活率检验原理及方法二.实验原理细胞培养液中加冷冻保护剂，并通过一定的冷冻程序冷冻细胞，一方面使细胞内形成的结晶体积较少，减少对细胞的机械性损坏；另一方面缓解细胞内因结晶引起的局部高渗对细胞的伤害。
《动物细胞工程》优秀教案
动物细胞工程
1、动物细胞工程常用的技术手段有：
①（基础）、②、
③动物细胞、④生产等。
2、动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的中，让这些细胞生长和增殖。
（1）动物细胞的培养过程：
①将组织分散成许多单个细胞。
方法是从动物体内取出组织块，剪碎，用
或处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞。
②用培养液将分散的细胞稀释制成，动物细胞培养时制备的细胞悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁，称为，要求培养瓶或培养皿的内表面、、易于。
当贴壁细胞分裂生长到时，细胞就会停止分裂增殖称为细胞的。
人们通常将动物组织消化后的初次培养称为。
③贴满瓶壁的细胞需要重新用等处理，然后分瓶培养，让细胞继续增殖，这样的培养通常称为。
④传代培养的细胞一般传至10代以后就不易下去了。
细胞在传至10~50代左右时，增殖会缓慢或停止。
少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限获得，正在朝着等同于的方向发展。
目前使用的或保存的正常细胞通常为以内，以保持细胞正常的核型。
（2）动物细胞培养的条件：
①的环境；对培养液和所有培养用具进行处理，还要添加一定量的，还应定期更换。
②营养与体内基本相同；需要有、、、、
等，还要加入、等天然成分。
③适宜的；
④（主要是氧气和二氧化碳，二氧化碳是，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于的混合气体的培养箱中进行培养）。
（3）动物细胞培养技术的应用：①生产生物制品
②用于检测有毒物质，判断物质的毒性
③用于生理、病理、药理等方面的研究。
动物细胞工程试验讲义(学生版)
实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。
即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。
无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。
任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。
1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。
2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。
消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。
通常用化学方法来达到消毒的作用。
灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。
应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。
能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。
对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。
在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。
灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。
灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。
可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。
3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。
实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。
主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。
4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。
动物细胞培养实验讲义
———————动物细胞培养 实验讲义——————— 实验一动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训一、实验目的1、掌握动物细胞培养相关设备、器材的使用方法。
2、掌握各类器皿、工具的清洗、包装、灭菌方法3、掌握各类培养基及试剂溶液的配制、灭菌方法二、实验原理离体条件下的细胞对任何有害物质均十分敏感，极少的残留物都可能对细胞产生毒副作用，因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，以达到不含任何残留物的要求。
而玻璃、橡胶、塑料、布类、纸类等不同类型的材料应采用不同的清洗和消毒、灭菌方法。
细胞培养失败的一个常见原因是微生物污染，有时是操作过中不规范造成的，有时则是相关用品本身有污染造成的，因此在培养细胞前各种用品均需要进行严格消毒或灭菌。
培养液是进行细胞体外培养最基本、最主要的条件之一，掌握常见培养液的成分、性质与配制方法是细胞培养操作者应具有的基本知识和能力。
三、实验内容1、设备（1）CO2培养箱CO2培养箱要提前消毒，有些自己带有高温干热灭菌功能，大部分则宜用“纯水擦洗――95%酒精擦洗——紫外照射杀菌”的消毒方法。
初次开启仪器时要提前一天矫正CO2的浓度值。
然后设定好温度等参数。
关于钢瓶的压力阀门控制：钢瓶上的阀门松紧程度不是十分重要，关键靠供气阀门控制压力在0.1（越拧紧压力越高，所以可先把供气阀门打到松弛状态，然后再开钢瓶阀门）（2）倒置显微镜打开电源开关，确保光路杆调至“观察”状态，选择所需放大倍数的物镜，调节至适当亮度。
将培养瓶放在载物台上，转动粗微调调节。
如需拍照，则在电脑中打开软件，并将光路杆调至“拍照”状态。
注意不要随便误打开荧光灯，以免浪费其寿命。
一旦打开荧光光源后，至少要15分钟后才能关闭，关闭后至少要5分钟才能再次开启。
（3）其他：高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。
2、器具（1）玻璃类细胞培养瓶（有的是塑料的）、吸管、三角烧瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶方法：玻璃类一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸过夜、自来水冲洗、然后依次用去离子水、一蒸水、三蒸水分别润洗5～6次。
动物细胞工程教案
自然科学发展处业务说明1.引言自然科学发展处是负责促进和推动自然科学领域发展的机构。
本文档旨在对自然科学发展处的业务进行说明，包括业务范围、工作流程以及重要任务等。
2.业务范围自然科学发展处的业务范围包括以下几个方面：2.1 科学研究项目管理自然科学发展处负责管理和支持科学研究项目，包括项目申请、项目资金管理、项目进展监管等。
其任务包括但不限于：•审查科研项目的申请书，确保项目的科学性、可行性和创新性。
•监督和分配科研经费，确保项目经费的合理分配和使用。
•定期检查项目进展情况，及时发现和解决问题，保证项目按时完成。
2.2 科技成果转化推动自然科学发展处负责推动科技成果的转化和应用，使科学研究成果能够为社会和经济发展做出贡献。
其任务包括但不限于：•指导和支持科学家将研究成果转化为实际应用，推动科技成果的产业化。
•组织科技成果的推广和推出，鼓励企业和社会机构采用科技成果。
•开展科技成果评估和技术转让工作，促进科技成果的流通。
2.3 国际科学交流与合作自然科学发展处负责组织和推动国际科学交流与合作，加强我国与其他国家在自然科学领域的交流与合作。
其任务包括但不限于：•组织和参与重要国际学术会议，促进学者之间的学术交流和合作。
•推动我国科学家与国际科学家的合作项目，加强国际科学团队的组建。
•提供国际科学研究课题的信息和资源，支持科学家开展国际合作项目。
3.工作流程自然科学发展处的工作流程如下：3.1 申请阶段科研项目申请人需按照规定的格式提交项目申请书，包括项目的目标、方法、计划等内容。
自然科学发展处将对申请书进行初步审查，确保项目的科学性和可行性。
3.2 审批阶段经过初步审查合格的项目申请将进入审批阶段。
自然科学发展处将组织专家对项目申请进行评审，评估项目的科学性、重要性和创新性。
评审结果将作为决策的重要参考依据。
3.3 资金管理阶段经审批通过的科研项目将获得相应的资金支持。
自然科学发展处将负责科研经费的管理和分配，确保项目经费的合理使用和监督。
动物细胞工程教案
动物细胞工程教案一、教学目标1. 了解动物细胞工程的基本概念和原理。
2. 掌握动物细胞培养的基本步骤和关键技术。
3. 理解动物细胞融合的方法和应用。
4. 能够分析动物细胞工程在生物技术和医学领域的应用。
二、教学内容1. 动物细胞工程的基本概念和原理定义：动物细胞工程是指通过细胞培养和细胞操作等技术，对动物细胞进行遗传改造和功能研究的一种生物技术。
原理：利用细胞膜的流动性、细胞增殖和分化的能力，通过体外培养和基因工程技术来实现对动物细胞的改造和应用。
2. 动物细胞培养的基本步骤和关键技术动物细胞培养的步骤：取材、消化、接种、培养、传代、冻存。
关键技术：无菌操作、细胞增殖与分化、细胞传代、细胞冻存。
三、教学方法1. 讲授法：讲解动物细胞工程的基本概念、原理、步骤和关键技术。
2. 演示法：展示动物细胞培养的实验操作过程，让学生直观地了解实验技术和方法。
3. 讨论法：组织学生讨论动物细胞工程的应用实例和未来发展，激发学生的思考和创新能力。
四、教学评估1. 课堂问答：通过提问方式检查学生对动物细胞工程基本概念和原理的理解。
2. 实验报告：评估学生在动物细胞培养实验中的操作技能和实验结果分析能力。
3. 小组讨论：评估学生在讨论中的思考深度和团队合作能力。
五、教学资源1. 教材：动物细胞工程相关的教科书或教材。
2. 实验器材：显微镜、细胞培养箱、无菌操作台、试管、培养皿等。
3. 网络资源：相关的研究论文、视频教程、在线课程等。
六、教学内容1. 动物细胞融合的方法和应用方法：电融合、化学融合、病毒融合。
应用：生产单克隆抗体、基因敲除、细胞治疗。
2. 动物细胞核移植技术概念：将一个细胞的细胞核移植到另一个去核的细胞中，形成重组细胞。
应用：克隆动物、研究基因表达调控、治疗某些遗传性疾病。
七、教学方法1. 讲授法：讲解动物细胞融合的方法、应用以及核移植技术的原理和应用。
2. 演示法：展示动物细胞融合和核移植的实验操作过程，让学生直观地了解实验技术和方法。
高一生物教案动物细胞工程教案-学习文档
高一生物教案动物细胞工程教案【】鉴于大家对自考考务考籍十分关注，小编在此为大家搜集整理了此文“高一生物教案动物细胞工程教案”，供大家参考!高一生物教案动物细胞工程教案选修本第15课时动物细胞工程知识精讲一、动物细胞工程常用技术——动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等; 技术是其他动物细胞工程技术的基础。
二、动物细胞培养1.过程：2.应用：① 大规模的生产重要价值的蛋白质生物制品② 烧伤病人植皮③ 培养的动物细胞用于检测有害物质④ 培养正常或病变细胞由于科研(如海拉细胞系)三、动物细胞融合1、动物细胞融合相当于植物体细胞杂交的过程。
2、动物细胞融合与植物细胞融合的基本原理同，诱导融合的方法基本相似，只是除法、法外，还用到方法——以作为诱导剂。
四、单克隆抗体概念：用单个B淋巴细胞进行，也就是通过，形成，这样的就可能产生出化学性质、的抗体——单克隆抗体。
制备：将免疫B淋巴细 C细胞D细胞A细胞B细胞胞与骨髓瘤进行细胞融合，经过后得到细胞。
这种细胞经过后能产生特定。
将这样的细胞群在条件下或注射到内增殖，这样就可以获得大量的单克隆抗体了。
应用：① 疾病诊断、治疗、预防，与常规抗体相比特异性强、灵敏度高;② 治疗癌症——“生物导弹”。
题例领悟例1.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是A.诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段完全相同C.所采用的原理完全相同D.都能形成杂种细胞解析：原理不同，方法和技术手段基本相同，但不完全相同。
答案：D例2.下图可表示细胞融合技术的一些过程，请巨图回答：(1)若A、B细胞为动物细胞，从A和B细胞到C细胞的过程中，常用作为来诱导融合。
(2)若A、B细胞为植物细胞，那么这样的细胞已经用酶降解脱掉了。
这种酶可能是酶，由此生成的A和B细胞称为。
(3)若A细胞为骨髓瘤细胞，B细胞为B淋巴细胞，那么D细胞称为细胞。
由D细胞连续分裂产生大量细胞的过程，称为过程。
《动物细胞工程学》实验课教学大纲
《动物细胞工程学》实验课程教学大纲实验名称：动物细胞工程学实验课程编码：0141014学时：32学分：2适用专业：生物工程执笔人：唐业刚审订人：郭云贵一、课程的性质与任务动物细胞培养技术是动物胚胎工程技术的基础和核心技术，开设该门实验课的最大任务和任务就是让学生掌握动物细胞培养技术的原理和基本方法，锻炼学生的专业素养。
应此，在教学过程中应着重培养和锻炼学生自己寻找感兴趣的小课题并能运用理论和实验操作知识独立进行实验设计、实验可行性等这种提出问题、分析问题和解决问题的能力。
二、教学目标与基本要求：了解动物细胞培养实验室的设计和基本设备。
理解动物细胞培养的实验原理和常用基本仪器设备的作用。
掌握常见大型仪器的使用方法和原代细胞培养、传代培养的流程和方法。
三、实验项目与类型：四、实验教学内容及学时分配：实验一、动物细胞一般培养过程教学录像观摩………………………………………（4学时）1.目的要求：了解动物细胞培养实验室组成、仪器及细胞培养的一般过程。
2.方法原理：通过观看教学录像，以及参观实验室，加深对动物细胞培养条件的理解；通过学习教学录像内容，认识到无菌操作技术在整个细胞培养实验中的重要作用。
3.掌握要点：熟悉动物细胞培养的总体流程；掌握实验所需的关键仪器设备的使用方法；认识到动物细胞培养比其他实验要求更高、更严。
4.实验内容：讲述动物细胞培养的发展历史。
观看录像，利用PPT多媒体教学手段观看细胞培养教学录像。
参观实验室的仪器设备及实验室设计，讲解仪器使用方法及实验室设计思路。
简要介绍该课程整体实验项目，课程考核方式及成绩评定办法等事宜说明。
实验二、实验室组成设计及实验容器具的洗涤、包扎和灭菌………………………（4学时）1.目的要求：掌握清洁液的配置方法；掌握动物细胞培养所用器皿的种类、作用及清洗灭菌方法；掌握滤器的使用方法2.方法原理：体外培养的动物细胞对微量有害物质十分敏感，了获得较好培养效果，对培养容器具的无害化处理是十分重要的。
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实验时间实验内容4月11日实验一培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二细胞的传代培养4月25日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401实验四染色体制备（6-10组）3015月2日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401实验四染色体制备（1-5组）3015月9日实验五细胞的复苏与冻存实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1.掌握常见培养用液的配制方法。
2.掌握常用的灭菌方法。
3.了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
【实验步骤】1．PBS（1000mL）的配制分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。
PBS 用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。
2．胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。
试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。
标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。
3．EDTA（0.2％）的配制、除菌与分装称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。
再用PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度为0.2%，用浓盐酸，调pH为7.2-7.4。
装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。
在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。
试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。
标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。
4．培养基的配制、除菌与分装将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。
工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。
将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。
试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。
标签上标明：MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。
用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%。
【注意事项】1.滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是抽滤法除菌。
2.培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无菌的液体，终浓度为100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素。
【思考题】1.配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？如何调节培养液的pH？2.生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？3.细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？实验二细胞的传代培养【实验目的】1.掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。
2.了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。
贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。
因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。
这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。
细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。
传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。
一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28℃，冷水鱼类细胞为15-20℃，水生哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。
单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培养基）倒入15 mL离心管，3000 rpm/min 离心5 min 备用。
培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。
酌情吸取2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再倒弃EDTA溶液；5．胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；6．中和消化：用移液管吸取旧培养基上清液3 mL（也可用新鲜生长培养基），加入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散；7．沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中，1000 rpm/min离心8分钟，获得细胞沉淀；8．加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液管吸取10 mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL，余下5mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与另外5mL培养基混匀；9．接种细胞：吸取5 mL上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各5 mL；10.静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培养（如果放入CO2培养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）；11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2代的传代。
【注意事项】1.传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。
要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞的操作，每一种细胞使用一套器材。
每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。
2.坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。
如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。
3.细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。
吹打细胞时，确保瓶壁所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。
4.培养箱不要反复多次开关，以免影响温度的稳定和增加污染的机率。
【思考题】1.贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。
2.常用的细胞消化液有哪些？各种消化液的作用原理分别是什么？3.悬浮生长的细胞如何传代培养？实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）【实验目的】1.掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。
2.了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。
【实验原理】细胞培养分为原代培养和传代培养。
原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械分离法等。
组织块法是直接从生物体获取组织，切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，通过培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让组织块周边慢慢地长出细胞来，经消化传代，获得大量均一的细胞，用于传代培养和相关细胞实验。