荧光和化学发光的基本知识
第三章分子荧光和化学发光
41
• 化学发光反应都包括化学激发和发光两个 步骤，则有
ψCL= ψCE·ψEN
(1)
• 式中ψCL为化学发光效率；ψCE为生成激发 态分子效率；ψEN为激发态发光效率，ψCL、 ψCE分别定义为：
42
生成激发态的分子数
CE 参加反应的分子数
10
(5)磷光发射 • 从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生
后，接着发生快速的振动弛豫而到达三重态 的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞 争时，在10-4~10s左右时间内 跃迁回基态而 发生磷光．
11
2. 激发光谱和发射光谱及其特征
Link
• Stokes位移． • 荧光发射光谱与激发波长的选择无关 • 镜像规则 二者呈镜像对称关系
35
• 荧光法定性和定量分析方法与紫外及可见吸收 光谱法相似，由实验得到的样品的荧光激发光 谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图比较可定 性分析样品成分．
• 在进行定量分析时，一般以激发光谱最大峰值 波长为激发光波长，以发射光谱最大峰值波长 为发射波长．
36
• 荧光法同样也可用于混合物的同时测定和络合 物组成的研究．
12
二、荧光强度与浓度的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： (ⅰ)分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光； (ⅱ)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率．
• 荧光量子产率(φ)也称荧光量子效率，它表示物质 发射荧光的能力，通常用下式 表示
13
发射的光量子数
20
三、荧光计和荧光分光光度计
• 用于测量荧光的仪器种类很多，从简单 的滤光荧光计到复杂的精密荧光分光光 度计．所用仪器的各部件和分光光度计 相类似(下图)．
荧光和化学发光的基本知识
化学发光检测方法
1.X光片压片（传统方法） 但曝光时间需要摸索，压片法有一定不便，定量也不准 2.扫描仪 一定波长范围扫描 3.成像仪 Cooled CCD 4.荧光化学发光酶标仪
化学发光在生物学检测中的应用
杂交检测中的信号物质（非放射性标记）： 1. 核酸杂交（Southern&Northern Blot） 2. 蛋白印迹（Western Blot） 3. 酶联免疫（Elisa） 4. 其他：
三、荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。
荧光发生是一个3阶段的过程。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
Luminol
和定量 • 激光扫描仪
荧光信号
荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度，光径 和稀释浓度，染料的荧光量子的产量，激发光源强度 和仪器荧光采集效率。在稀释溶液或悬液中，荧光强 度与这些参数成线性比例关系。
化学发光
化学发光的原理
某些荧光物质（例如Luminol, C8H7N3O2）可將化学反应中产生的能 量，转化成使分子內的电子由基态（ground state）跃升到激发态（excited state），处于激发态的分子并不穩定，將能量以光的形式释放出來；有的 光波长为可见光范围，但占多数的是荧光（fluorescence）。
原子发射光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱是分析化学中常见的光谱技术，它们在原子结构分析和元素检测等方面具有重要的应用价值。
然而，这三种光谱具有不同的原理和特点。
下面将分别介绍原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱的区别。
一、原子发射光谱1. 原理：原子发射光谱是利用原子在能级跃迁时所发射的特征光谱线进行分析的一种技术。
当原子受到激发能量后，原子的电子会跃迁至较高的能级，而后再跃迁至较低的能级时会发射出特征波长的光谱线。
通过测量这些特征光谱线的强度和波长，可以确定样品中各种元素的含量和种类。
2. 应用：原子发射光谱广泛应用于金属材料分析、环境污染物检测、地质勘探等领域，尤其在工业生产中具有重要的应用价值。
3. 优势：原子发射光谱的灵敏度高、测定范围广，能够同时检测多种元素，具有较高的分析精度和准确度。
二、荧光光谱1. 原理：荧光光谱是利用物质在受到紫外光激发后，发射出荧光光谱进行分析的一种技术。
当样品受到紫外光激发后，部分分子会吸收能量并跃迁至激发态，随后分子会再跃迁至基态并发射出荧光光谱，通过测量荧光光谱的强度和波长，可以得到样品的成分和结构信息。
2. 应用：荧光光谱在生物医学、材料科学、环境监测等领域具有广泛的应用，尤其在生物分析和药物检测中得到广泛应用。
3. 优势：荧光光谱对于生物分子具有较高的灵敏度和选择性，能够实现实时、非破坏性的分析。
三、化学发光光谱1. 原理：化学发光光谱是利用化学反应产生的发光进行分析的一种技术。
当两种或多种试剂混合后，在化学反应的作用下产生的化学发光可以被测定，通过测量化学发光的强度和时间，可以获得样品的化学成分和反应动力学信息。
2. 应用：化学发光光谱广泛应用于医学诊断、食品安全检测、环境监测等领域，尤其在微量分析和实时检测方面具有重要意义。
3. 优势：化学发光光谱对于微量物质具有较高的检测灵敏度和快速响应性，适用于多种复杂样品的分析。
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱分别具有不同的原理和应用特点，它们在元素分析和化学反应动力学研究中发挥着重要的作用。
化学发光和荧光的性质与应用
化学发光和荧光的性质与应用化学发光和荧光是一种具有独特性质和应用的化学现象。
这一现象在科学、工业、医药等领域有着广泛的应用。
化学发光，也称为化学发光分析或化学发光测定，是一种利用化学反应发生时产生的光来分析化合物的方法。
这种方法具有灵敏度高、分析速度快、对样品的数量要求低等优点，因此被广泛应用于环境监测、食品检测、医药研究等领域。
其中，最具代表性的化学发光方法是电化学发光法和化学发光酶标法。
电化学发光法利用电化学反应产生的活性中间体在后续反应中发生化学发光的方法。
这种方法对微量物质具有高度灵敏度，因此常被用于分析无机和有机化合物等微量物质。
化学发光酶标法则是利用化学发光酶标记化合物的方法进行检测。
这种方法处理简单，样品数量要求低，因此在食品、药品、环境检测等领域得到广泛应用。
荧光是一种发射可见光或紫外线的现象。
荧光分为自发荧光和诱导荧光两种类型。
其中，自发荧光通常是一些化合物在受到紫外线、X射线或自然光刺激后，从低能态激发至高能态，然后再退到低能态时发出的光。
而诱导荧光则是在化合物发生化学反应过程中，受到某些物质的激发而发出光。
荧光的应用领域广泛，如环境检测、医药研究、生物成像等。
其中，荧光成像技术则是一种用于研究生物过程和诊断疾病的重要手段。
通过对受体蛋白、细胞膜等进行染色，可以直接观察到这些物质在细胞内的动态变化。
同时，荧光成像技术在抗癌药物筛选、生物传感器等领域也有着广泛的应用。
在化学发光和荧光应用的同时，也面临着一些问题。
例如，荧光染料的选择和性能优化，化学发光方法的准确性和可靠性等。
因此，未来需要通过不断的技术创新和研究来解决这些问题，推动化学发光和荧光技术的应用和发展。
化学发光法免疫荧光法
化学发光法免疫荧光法
化学发光是利用化学反应产生的能量促使产生能级跃迁，从而发光，典型的如鲁米诺检测血迹；荧光是一种光致发光现象，必须提供光源去激发分子产生能级跃迁，进而发光。
使用上述两种方法进行免疫分析时，其区别很明显，化学发光无需外加光源，背景干扰小；而荧光则需要外加光源，在垂直光源的方向上检测，生物样品中的蛋白质、氨基酸等分子也会产生背景荧光，背景稍高一些，需要选择合适的荧光试剂，以及样品处理方法以减少非特异性吸附蛋白的影响。
免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光化学发光法免疫分析是其中典型的两种。
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
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5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
51
3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
化学发光收
化学发光收1. 前言化学发光是指在某些化学反应中，吸收了外部能量，然后通过一系列的能量释放和跃迁，产生明亮的发光现象。
该现象既能用于科学研究，也可以用于工业生产和日常生活中。
2. 化学发光的基本原理化学发光的基本原理是发光体发生化学反应后产生的化学能以光学形式传递出来，即“荧光”。
荧光是指在吸收电磁辐射（如紫外光）后，产生可见光的现象。
化学反应中能量的跃迁是化学发光的关键。
该跃迁可能是电子从一个能级跃迁到另一个能级造成的，也可能是分子结构的改变，能量的释放导致的。
化学发光通常可以分为两类：荧光和化学发光。
荧光是指在化学反应中由吸收外部能量所产生的光辉，在外部能量消失后可以持续较长的时间。
而化学发光，则是在一系列化学反应中由能量的释放产生的短暂而强烈的光辉。
3. 化学发光的应用3.1. 生物医学领域化学发光技术作为一种非常敏感的检测技术，应用非常广泛。
在生物医学领域，化学发光可以被用于分析和检测各种生物分子，如蛋白质、DNA、RNA等。
此外，化学发光还可以用于分析细胞和细胞表面分子的表达和功能。
3.2. 环境分析化学发光技术还可以被用于环境污染分析领域。
例如，可以用化学发光技术测量水中的有机化合物或毒素等有害物质的浓度，这对于环保监测十分重要。
3.3. 工业生产化学发光技术还可以被用于工业生产中。
例如，可以用化学发光检测药品、化妆品、食品等中的活性成分、对照剂以及仪器的操作效果等。
3.4. 安防领域化学发光技术还可以被用于安防领域。
例如，在防伪荧光材料、消防、安全出口灯光等方面有着广泛的应用。
4. 化学发光的展望随着科学技术的不断发展，化学发光技术在各个领域的应用越来越广泛。
尤其是随着生物医学和环保监测等领域的快速发展，对化学发光技术的需求也在不断增加。
展望未来，化学发光技术的应用前景将会更为广阔。
例如，近年来，部分科学家已经开始探索利用化学发光技术研发便携式的光学传感器，这种传感器可以快速、高效地响应环境污染和安全监测等需要。
化学发光和荧光的原理和应用
未来，化学发光和荧光技术将与人工智能、大数据等先进技术结合，实现更高效、精准的应 用。
技术的不断创新将推动化学发光和荧光技术的发展，为人类带来更多的便利和福祉。
THANKS
汇报人：XX
添加 标题
应用：用于生物分子相互作用的研究，如 蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用， 以及生物分子构象变化的研究。
添加 标题
优势：灵敏度高、特异性强、可以实时监 测生物分子间的相互作用。
添加 标题
局限性：需要特定的激发光源和检测器， 且荧光共振能量转移过程中涉及的能量转 移效率较低。
荧光显微镜和光谱学
化学发光和荧光的原理 和应用
XX,a click to unlimited possibilities
汇报人：XX
目录
01 化 学 发 光 和 荧 光 的 原理
03 荧 光 的 应 用 05 化 学 发 光 和 荧 光 技
术的未来发展
02 化 学 发 光 的 应 用 04 化 学 发 光 和 荧 光 技
应产生。
激发态和能量 传递在化学发 光和荧光中起 着关键作用， 影响发光性质
和应用。
Part Two
化学发光的应用
生物检测
化学发光技术用于生物检测，如免 疫分析、核酸检测等
荧光技术常用于生物成像和荧光探 针，可对细胞和组织进行可视化研 究
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
化学发光技术具有高灵敏度、高特 异性的优点，可用于痕量物质的检 测
荧光技术可以用 于检测生物体内 的物质，如蛋白 质、核酸等，而 化学发光技术则 更适用于检测小 分子物质，如激 素、药物等。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
荧光分析与化学发光分析
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
3. 化合物的荧光和化学结构的关系 产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须具有 能吸收紫外或可见光的生色基团；其次该物质应具有一定的 荧光效率。分子中能发射荧光的基团，称为荧光基团。荧光 基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这 是由于它的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂 分子或其他溶质分子之间的相互碰撞，因此不能发射荧光。 荧光效率(ΦF)又称为荧光量子产率，是荧光物质吸光后所 发射的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值，即
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
荧光光谱知识
荧光光谱教程一、化学发光反应的类型1．直接化学发光和间接化学发光化学发光反应可分直接发光和间接发光。
直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。
表示如下：式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射出光子hv。
间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。
如下式表示式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。
例如，用罗丹明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气的O3，其化学发光反应就属这一类型。
没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射出光子。
该光辐射的最大发射波长为584nm。
2. 气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态来分类，如化学发光反应在气相中进行称气相化学发光，在液相或固相中进行称液相或固相化学发光，在两个不同相中进行则称为异相化学发光。
本节主要讨论气相和液相化学发光，其中液相化学发光在痕量分析中更为重要。
（1）气相化学分光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。
☆臭氧与乙烯的化学发光反应机理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同时产生化学发光，发光物质是激发态的甲醛。
这个气相化学发光的最大波长为435nm，发光反应对O是特效的，线性响应范围为1ng·mL-1～1μg·mL-1。
☆一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为：这个反应的发射光谱范围为600～875nm，灵敏度可达1ng·mL-1。
若需同时测定大气中的NO2时，可先将NO2还原为NO，测得NO总量后，从总量中减去原试样中NO的含量，即为NO2 的含量。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是现代生物医学研究和临床诊断中常用的分析方法。
这两种方法在原理和应用中有一些差异，但都具有高灵敏度、高选择性和高自动化程度的特点。
以下将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用和优缺点。
荧光免疫分析方法是基于荧光分子的发射特性进行分析的一种方法。
其原理是，通过标记抗体或抗原的荧光物质，使其具有荧光，并与待测物发生特异性的免疫反应。
然后，通过荧光测定仪器对免疫反应产生的荧光进行检测和分析。
荧光免疫法具有高灵敏度、高选择性、多样化的荧光标记物选择以及可通过多色荧光分析多个指标等特点。
因此在生物医学研究、肿瘤标志物筛查、病毒感染和免疫补体等方面具有广泛的应用。
荧光免疫分析方法主要分为直接荧光免疫分析和间接荧光免疫分析。
直接荧光免疫分析通过将荧光标记物直接结合到抗体或抗原上，实现荧光信号的检测和分析。
间接荧光免疫分析则是先将抗体与细胞或蛋白质结合，然后再用荧光标记的二级抗体结合到一级抗体上，以增强荧光信号。
这两种方法各有优缺点，可以根据具体需要选择使用。
化学发光免疫分析方法是基于化学发光反应进行分析的一种方法。
其原理是，在特定的化学反应条件下，荧光标记的抗体或抗原与待测物发生免疫反应，产生化学发光信号。
然后通过化学发光仪器对化学发光信号进行检测和分析。
化学发光免疫方法具有高灵敏度、快速、特异性高、背景干扰低等优点，因此在临床诊断和分子生物学研究中得到广泛应用。
化学发光免疫分析方法主要分为催化化学发光和基因工程发光两种类型。
催化化学发光是通过特定的酶促发光底物，在酶的作用下产生化学发光信号。
催化化学发光免疫分析方法常用于免疫分析和临床诊断。
基因工程发光则是通过将荧光基因植入生物体内，利用生物体自身的酶促发光反应产生化学发光信号。
基因工程发光免疫分析方法主要用于分子生物学研究领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在临床诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。
它们可以用于检测血液中的肿瘤标志物、感染性疾病的病原体抗原和抗体、免疫系统功能等指标。
荧光和化学发光分析法
P15
02
A 跃迁的类型 n →π* εmax＜100 平均寿命10-5~10-7 s； π→π* εmax≥104 平均寿命10-7~10-8 s π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有π*→π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光。 2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系 荧光的产生是分子先经历π→π* 或n →π* 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生π* →π 或π* → n 而得到荧光。
光源
样品池
激发 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
发射 单色器
斩波器（磷光镜）
利用荧光和磷光发射寿命的差别
通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。
2、定量方法
*
定量依据
定量分析方法
2.1.4 定量分析方法
*
1、定量依据 荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子产率Φ ： 由朗伯-比耳定律得： 荧光强度 If ：
外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。
02
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
2.1.1.1 荧光及其产生
*
（1）. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。 e 2、辐射跃迁
实验条件对荧光强度的影响
溶液黏度和温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。 温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。
溶液的PH值 不同PH值下，荧光分子存在形式不同。
Cary Eclipse 荧光分光光度计
2.1.3 仪器装置
完整版荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光波长范围
化学发光波长范围
化学发光是指某些化学物质在受到激发后，能够发出特定波长的光。
化学发光波长范围通常取决于所使用的化学物质和激发能量等因素。
以下是一些典型的化学发光波长范围：
1. 荧光：荧光是指某些物质在受到激发后，能够发出长波长的光。
荧光波长范围通常在紫外线和蓝色光之间，例如蓝色荧光材料的波长范围为450~500nm。
2. 磷光：磷光是指某些物质在受到激发后，能够发出长波长的光。
磷光波长范围通常在紫外线和红色光之间，例如红色磷光材料的波长范围为500~700nm。
3. 化学发光：化学发光是指某些化学物质在受到激发后，能够发出特定波长的光。
化学发光波长范围通常在紫外线和蓝色光之间，例如硝酸盐发光材料的波长范围为300~500nm。
需要注意的是，不同的化学物质和激发方式可能会产生不同的化学发光波长范围。
第六章分子发光荧光磷光及化学发光
反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem
共振荧光(Resonance)：
λex = λem
2. 分子荧光(磷光)光谱
(1) 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发 射出不同波长的荧光。
MX n hvi MX* I F 4 8 0 0
４．内转换
内转换指的是相同多重度等能态间的一 种无辐射跃迁过程．当两个电子能级的 振动能层间有重叠时，则可能发生电子 由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能 层的电子的激发态．内转换过程在1013~10-11s时间内发生，它通常要比由高 激发态直接发射光子的速度快得多．
５．外转换
激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相 互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减 弱甚至消失的过程称外转换．这一现象称 为“熄灭”或“猝灭”．
直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用 分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些， 才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波 长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧 光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而 提出“荧光”这一术语。
1867年，Goppelsroder进行了 上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
υ
, 1
子 可 见
υＳ,01 υ2 υ1 υ0
吸
收
光
谱
3
2 1
J
0
3
2 1
J
0
3
2 1
J
0
3
Ｓ0
2 1
J
0
远红外光谱
λ振动 25~1.25μm
化学发光和荧光的应用
化学发光和荧光的应用化学发光和荧光是现代科技中广泛应用的技术，它们是利用分子能级的变化而产生的光现象。
从基础科学研究到实际应用，发光和荧光技术已经涉及各个领域。
一、化学发光的应用化学发光在现代生命科学研究中扮演着重要的角色，例如生物分析和药物开发。
生命体系中许多化合物，如酶和基因，都可以通过化学反应产生荧光和发光。
作为一种常见的化学发光技术，发光酶（如荧光素酶）可以被用来研究细胞活动、生物分子互动等生物学现象。
荧光素衍生物是常见的发光剂，它们在分析生物样品的蛋白质和肽类中被广泛使用，例如蛋白质分离、定量等实验。
此外，化学发光技术已经应用于各种应用程序中，如火灾探测和广告板显示。
二、荧光的应用荧光是一种常用的照明技术，在照明、展览、科普和装饰等方面广泛应用。
荧光体可以分类为三种，即荧光染料、荧光及荧光分子。
荧光染料是一种广泛应用于荧光染色的化合物。
在生物技术中，荧光染料可以用于细胞成像、荧光原位杂交和蛋白质标记等领域。
同时，由于其发射光谱较广并能够产生多种颜色，荧光染料还可以用于印刷和染色行业。
荧光剂也常用于检测空气污染和水污染，特别是代表荧光和荧光染料的颜色和染色效果很适合用于分析机器使用。
荧光固体材料，如荧光玻璃、荧光晶体等，因其良好的荧光效果而被广泛用于装饰和指示灯。
此外，在科学研究中，荧光也被用于固体摩擦的研究和纳米材料的表征。
大多数荧光体都发射单一颜色的光，但有许多能够发射多个颜色的微型荧光体和荧光纳米颗粒。
在科学研究领域中，这些多重发射荧光体常用于细胞成像的研究中。
总的来说，化学发光和荧光技术在各个领域中都是不可或缺的技术，在科学研究和现实生活中扮演着重要角色。
第5章荧光法与化学发光法解读.
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
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硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
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5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
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荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。
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常见的荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物
Байду номын сангаас
荧光熄灭的形式：
a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化
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（2）产生荧光的必备条件
强紫外-可见吸收 一定的荧光效率
π→π*跃迁
强吸收带
n →π*跃迁
弱吸收带
存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。
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2．影响荧光强度的结构因素
(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应
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(1)共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的 π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度 （荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例
4
5.1.1
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② 激发态的寿命期
激发态存在一个有限的时间 （通常是1-10x10-9秒）。在这时 间，荧光体经历构象的改变和容易 受到分子环境的相互作用的影响。 这些过程有两个重要的结果。第 一， S1’的能量部分被消耗，形成一 个衰减的单峰激发态（ S1 ）即荧光 发射的初始。第二，不是最初被激 发的所有分子都通过荧光发射回到 基态。其他的过程，象振动淬灭， 荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量 子的产生量，取决于激发的荧光光 子数量与吸收的光子数量的比率， 是衡量荧光效率的参数。
荧光量子产率（ϕ）：
ϕ
=
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的 速率常数有关。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
¾发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录 的样品发射荧光的强度。 ¾激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的 激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光光谱
荧光寿命
¾定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一 定程度时所用的时间。 ¾各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高 （≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。
光 6. 磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会
持续发光 7. 化学发光(chemiluminescence>-非生物体把多余的化学能转变
为光能 8. 生物发光(bioluminescence)-生物体利用化学能发光
什么是荧光？
荧光物质吸收激发光的能量后，电 子从基态跃迁到激发态，当其回复至基 态时，以发射光形式释放出能量，称为 荧光。
③ 荧光发射
能量（hvEM）光子被激发，荧 光体回到基态S0。由于能量在激发 态寿命期的部分消耗，这些光子的 能量较低，因此比激发光子hvEX有 更长的波长。这种由于（hvEM - hvEX） 呈现的能量或波长的差异称作 Stokes漂移。Stokes 漂移奠定了荧光 技术灵敏性的基础，因为它可以与 激发光子在光谱上分离，而在一个 较低的背景下检测发射光子。相比 较而言，吸收光分光测定法在透射 光检测时相对于较高水平的同一波 长的光。
595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
550nm 490-560nm
7-氨基-4-甲基香豆素 354nm
Eu3+螯合物
340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、流式细胞术
三、荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。
5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
六、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质
异硫氰酸荧光素 (FITC)
最大吸收光谱
最大发射光谱
应用
490～495ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱm 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。
荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。
荧光发生是一个3阶段的过程。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
七、荧光检测
荧光检测仪器
荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光 子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出， 通常是电子信号或图像。
五、影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺 酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端 重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光
Excitation Emission
F
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递
Excitation
Transfer
F1
F2
Emission
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热
Excitation
Transfer
F BH
二、荧光发射光谱和激发光谱
荧光和化学发光的基本知识
光的基本知识
按光谱分类： 狭义：可见光（400-700nm） 广义：紫外光（ 10-400nm）
可见光（400-700nm） 红外光（700-40000nm）
发光物质
1. 炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光 2. 气体激发(gas excitation>-因电子或热的激发而发光 3. 摩擦发光(triboluminescence) 4. 电激發光(electroluminescence) 5. 荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发