荧光和化学发光的基本知识
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荧光和化学发光的基本知识
光的基本知识
按光谱分类： 狭义：可见光（400-700nm） 广义：紫外光（ 10-400nm）
可见光（400-700nm） 红外光（700-40000nm）
发光物质
1. 炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光 2. 气体激发(gas excitation>-因电子或热的激发而发光 3. 摩擦发光(triboluminescence) 4. 电激發光(electroluminescence) 5. 荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发
五、影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺 酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端 重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光
Excitation Emission
F
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递
Excitation
Transfer
F1
F2
Emission
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热
Excitation
Transfer
F BH
二、荧光发射光谱和激发光谱
三、荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。
荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。
荧光发生是一个3阶段的过程。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
荧光量子产率（ϕ）：
ϕ
=
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的 速率常数有关。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
¾发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录 的样品发射荧光的强度。 ¾激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的 激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光光谱
荧光寿命
¾定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一 定程度时所用的时间。 ¾各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高 （≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。
③ 荧光发射
能量（hvEM）光子被激发，荧 光体回到基态S0。由于能量在激发 态寿命期的部分消耗，这些光子的 能量较低，因此比激发光子hvEX有 更长的波长。这种由于（hvEM - hvEX） 呈现的能量或波长的差异称作 Stokes漂移。Stokes 漂移奠定了荧光 技术灵敏性的基础，因为它可以与 激发光子在光谱上分离，而在一个 较低的背景下检测发射光子。相比 较而言，吸收光分光测定法在透射 光检测时相对于较高水平的同一波 长的光。
5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
六、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质
异硫氰酸荧光素 (FITC)
最大吸收光谱
最大发射光谱
应用
490～495nm 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm
595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
550nm 490-560nm
7-氨基-4-甲基香豆素 354nm
Eu3+螯合物
340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、流式细胞术
光 6. 磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会
持续发光 7. 化学发光(chemiluminescence>-非生物体把多余的化学能转变
为光能 8. 生物发光(bioluminescenceຫໍສະໝຸດ Baidu-生物体利用化学能发光
什么是荧光？
荧光物质吸收激发光的能量后，电 子从基态跃迁到激发态，当其回复至基 态时，以发射光形式释放出能量，称为 荧光。
② 激发态的寿命期
激发态存在一个有限的时间 （通常是1-10x10-9秒）。在这时 间，荧光体经历构象的改变和容易 受到分子环境的相互作用的影响。 这些过程有两个重要的结果。第 一， S1’的能量部分被消耗，形成一 个衰减的单峰激发态（ S1 ）即荧光 发射的初始。第二，不是最初被激 发的所有分子都通过荧光发射回到 基态。其他的过程，象振动淬灭， 荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量 子的产生量，取决于激发的荧光光 子数量与吸收的光子数量的比率， 是衡量荧光效率的参数。
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
七、荧光检测
荧光检测仪器
荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光 子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出， 通常是电子信号或图像。
光的基本知识
按光谱分类： 狭义：可见光（400-700nm） 广义：紫外光（ 10-400nm）
可见光（400-700nm） 红外光（700-40000nm）
发光物质
1. 炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光 2. 气体激发(gas excitation>-因电子或热的激发而发光 3. 摩擦发光(triboluminescence) 4. 电激發光(electroluminescence) 5. 荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发
五、影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺 酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端 重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光
Excitation Emission
F
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递
Excitation
Transfer
F1
F2
Emission
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热
Excitation
Transfer
F BH
二、荧光发射光谱和激发光谱
三、荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。
荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。
荧光发生是一个3阶段的过程。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
荧光量子产率（ϕ）：
ϕ
=
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的 速率常数有关。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
¾发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录 的样品发射荧光的强度。 ¾激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的 激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光光谱
荧光寿命
¾定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一 定程度时所用的时间。 ¾各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高 （≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。
③ 荧光发射
能量（hvEM）光子被激发，荧 光体回到基态S0。由于能量在激发 态寿命期的部分消耗，这些光子的 能量较低，因此比激发光子hvEX有 更长的波长。这种由于（hvEM - hvEX） 呈现的能量或波长的差异称作 Stokes漂移。Stokes 漂移奠定了荧光 技术灵敏性的基础，因为它可以与 激发光子在光谱上分离，而在一个 较低的背景下检测发射光子。相比 较而言，吸收光分光测定法在透射 光检测时相对于较高水平的同一波 长的光。
5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
六、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质
异硫氰酸荧光素 (FITC)
最大吸收光谱
最大发射光谱
应用
490～495nm 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm
595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
550nm 490-560nm
7-氨基-4-甲基香豆素 354nm
Eu3+螯合物
340nm
620nm（橙红色）
595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、流式细胞术
光 6. 磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会
持续发光 7. 化学发光(chemiluminescence>-非生物体把多余的化学能转变
为光能 8. 生物发光(bioluminescenceຫໍສະໝຸດ Baidu-生物体利用化学能发光
什么是荧光？
荧光物质吸收激发光的能量后，电 子从基态跃迁到激发态，当其回复至基 态时，以发射光形式释放出能量，称为 荧光。
② 激发态的寿命期
激发态存在一个有限的时间 （通常是1-10x10-9秒）。在这时 间，荧光体经历构象的改变和容易 受到分子环境的相互作用的影响。 这些过程有两个重要的结果。第 一， S1’的能量部分被消耗，形成一 个衰减的单峰激发态（ S1 ）即荧光 发射的初始。第二，不是最初被激 发的所有分子都通过荧光发射回到 基态。其他的过程，象振动淬灭， 荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量 子的产生量，取决于激发的荧光光 子数量与吸收的光子数量的比率， 是衡量荧光效率的参数。
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
七、荧光检测
荧光检测仪器
荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光 子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出， 通常是电子信号或图像。