外源基因的表达和转基因生物的鉴定.
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第八章 外源基因的表达和转 基因生物的鉴定
第一节
外源基因在受体中的表达
一、外源基因在受体中表达的一般特征
（一）原核基因在原核细胞中的表达
转录：需强启动子 翻译：（1）起始密码子 （2）SD序列
（二）真核基因在真核细胞中的表达
只要外源基因与受体组织具有相同的基因表达系统， 就可在宿主细胞中表达，更确切地说，只要外源基因 具有真核基因特有的启动子及其它控制序列，则它们 就能正常表达。
质粒拷贝数对细胞生长速率的影响
带有质粒的大肠杆菌HB101 无 A B 质粒拷贝数 0 12 24 相对生长速率/% 1.00 0.92 0.91
C
D E
60
122 408
0.87
0.82 0.77
三、外源基因在植物中的表达
1、同源性表达和异源性表达
同源性表达（homologous expression）指来源于相同物种 的基因（即来源于植物基因）在植物受体细胞中的表达 。
第二节 转基因生物的鉴定
一、个体水平鉴定
个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导 转化体表现其性状特征或生理特征。
二、细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断
外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中 应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会 损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测 特性。
（四）原核基因在真核细胞中的表达
原核基因在真核细胞中的表达主要是表达产物的剂量 问题，剂量较少又是因为原核基因组和真核基因组的 结构特征有差异，因而有表达障碍。
二、原核细胞高效表达外源基因
1、形成融合蛋白 N端：由原核DNA序列编码，
融合蛋白
C端：由真核DNA的完整序列编码。
可以通过两步亲和层析来进行纯化： （1）将含有融合蛋白的粗制样品，通过特定的亲和层析柱， 使融合蛋白和柱上的配基进行亲和作用而吸附到层析柱上， 将杂蛋白洗净后，再将融合蛋白洗脱下来。
（2）将纯化的融合蛋白进行化学或酶法裂解后，再上同 样的亲和层析柱，此时融合伙伴蛋白或亲和柄吸附到柱上， 而流出液则含有纯化的目标蛋白。
2、外源蛋白的分泌表达 外源蛋白可能积累的方式有三种，即出现于细胞质、周质 及细胞外培养基中。 （1）存在于细胞质 容易形成包含体，蛋白质已经折叠了，纯化后再折 叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性。
外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处：
（1）可以简化发酵后的纯化工艺。
（ 2）保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构。在大肠 杆菌中表达的外源蛋白很多都保留有N端的Met，Met的存在就 可能影响到表达蛋白的生物活性或免疫原性。通过基因设计， 就可以去除Met。
（3）外源蛋白生物活性的高低，依赖于蛋白的正确折叠，而 分泌表达设计，有利于正确构象的形成。
稳定表达（stable expression）：转化的外源基因在细胞水平 可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且 可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。
3、组成型表达和发育特异性表达
组成型表达（constitutive expression）指表达是持续的， RNA及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变， 也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
异源表达困难的原因：是因为不同物种 RNA聚合酶所识别 的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。
2、瞬时表达和稳定表达
瞬时表达（transient expression）：在受体中表达一个细胞 周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。
（4）将外源蛋白分泌到周质或培养基中，就减少了外源蛋 白被蛋白水解酶降解的机会，可提高蛋白的回收率。
(2)存在于周质 由于周质中蛋白种类少，目标蛋白纯化较为简单； 蛋白酶解程度不甚严重；
促进二硫键的形成及蛋白质的折叠作用；
蛋白质N-末端结构真实。
（3）存在于胞外
蛋白质酶解作用最低； 目标蛋白容易纯化； 增进了蛋白质的折叠作用； 蛋白质N-末端结构真实。
4、条件诱导表达
（1）热诱导表达 某些植物（如大豆、玉米等）暴露在高温下（通常在35℃ 以上）细胞可在1～3小时内合成一些新的蛋白质或增大特 异蛋白质的合成量。若将植物放回正常温度下，正常的蛋 白质合成可以在30分钟内恢复。 （2）共生细菌诱导表达
豆血红蛋白是由一组基因编码的，在大豆中现已找到4个含有 该蛋白质编码序列的连锁区段，其中包括4个正常基因（1ba， lbcl，1bc3）和1个假基因。将大豆血红蛋白1bc3基因的5′和 3′区段连接到编码CAT通告酶的编码序列上，再将此嵌合基 因引入到一种异源豆科植物百脉根中，结果在未感染根瘤菌的 转基因植株的任何组织中都未检测到表达；但当转基因百脉根 植株的根用根瘤菌感染时，在根瘤发育的特定阶段（此时豆血 红蛋白被正常诱导）检出了高水平的CAT表达。
3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达
该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的 表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源 基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λ cI857
（2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的 复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞 中重组DNA的复制。
（三）、真核基因在原核细胞中的表达
存在困难： ①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。 ②ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除 后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞 的转录后加工系统。 ③在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖 核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转 录的mRNA缺少SD序列。 ④真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定， 容易被细胞蛋白酶所破坏。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
第一节
外源基因在受体中的表达
一、外源基因在受体中表达的一般特征
（一）原核基因在原核细胞中的表达
转录：需强启动子 翻译：（1）起始密码子 （2）SD序列
（二）真核基因在真核细胞中的表达
只要外源基因与受体组织具有相同的基因表达系统， 就可在宿主细胞中表达，更确切地说，只要外源基因 具有真核基因特有的启动子及其它控制序列，则它们 就能正常表达。
质粒拷贝数对细胞生长速率的影响
带有质粒的大肠杆菌HB101 无 A B 质粒拷贝数 0 12 24 相对生长速率/% 1.00 0.92 0.91
C
D E
60
122 408
0.87
0.82 0.77
三、外源基因在植物中的表达
1、同源性表达和异源性表达
同源性表达（homologous expression）指来源于相同物种 的基因（即来源于植物基因）在植物受体细胞中的表达 。
第二节 转基因生物的鉴定
一、个体水平鉴定
个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导 转化体表现其性状特征或生理特征。
二、细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断
外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中 应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会 损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测 特性。
（四）原核基因在真核细胞中的表达
原核基因在真核细胞中的表达主要是表达产物的剂量 问题，剂量较少又是因为原核基因组和真核基因组的 结构特征有差异，因而有表达障碍。
二、原核细胞高效表达外源基因
1、形成融合蛋白 N端：由原核DNA序列编码，
融合蛋白
C端：由真核DNA的完整序列编码。
可以通过两步亲和层析来进行纯化： （1）将含有融合蛋白的粗制样品，通过特定的亲和层析柱， 使融合蛋白和柱上的配基进行亲和作用而吸附到层析柱上， 将杂蛋白洗净后，再将融合蛋白洗脱下来。
（2）将纯化的融合蛋白进行化学或酶法裂解后，再上同 样的亲和层析柱，此时融合伙伴蛋白或亲和柄吸附到柱上， 而流出液则含有纯化的目标蛋白。
2、外源蛋白的分泌表达 外源蛋白可能积累的方式有三种，即出现于细胞质、周质 及细胞外培养基中。 （1）存在于细胞质 容易形成包含体，蛋白质已经折叠了，纯化后再折 叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性。
外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处：
（1）可以简化发酵后的纯化工艺。
（ 2）保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构。在大肠 杆菌中表达的外源蛋白很多都保留有N端的Met，Met的存在就 可能影响到表达蛋白的生物活性或免疫原性。通过基因设计， 就可以去除Met。
（3）外源蛋白生物活性的高低，依赖于蛋白的正确折叠，而 分泌表达设计，有利于正确构象的形成。
稳定表达（stable expression）：转化的外源基因在细胞水平 可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且 可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。
3、组成型表达和发育特异性表达
组成型表达（constitutive expression）指表达是持续的， RNA及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变， 也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
异源表达困难的原因：是因为不同物种 RNA聚合酶所识别 的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。
2、瞬时表达和稳定表达
瞬时表达（transient expression）：在受体中表达一个细胞 周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。
（4）将外源蛋白分泌到周质或培养基中，就减少了外源蛋 白被蛋白水解酶降解的机会，可提高蛋白的回收率。
(2)存在于周质 由于周质中蛋白种类少，目标蛋白纯化较为简单； 蛋白酶解程度不甚严重；
促进二硫键的形成及蛋白质的折叠作用；
蛋白质N-末端结构真实。
（3）存在于胞外
蛋白质酶解作用最低； 目标蛋白容易纯化； 增进了蛋白质的折叠作用； 蛋白质N-末端结构真实。
4、条件诱导表达
（1）热诱导表达 某些植物（如大豆、玉米等）暴露在高温下（通常在35℃ 以上）细胞可在1～3小时内合成一些新的蛋白质或增大特 异蛋白质的合成量。若将植物放回正常温度下，正常的蛋 白质合成可以在30分钟内恢复。 （2）共生细菌诱导表达
豆血红蛋白是由一组基因编码的，在大豆中现已找到4个含有 该蛋白质编码序列的连锁区段，其中包括4个正常基因（1ba， lbcl，1bc3）和1个假基因。将大豆血红蛋白1bc3基因的5′和 3′区段连接到编码CAT通告酶的编码序列上，再将此嵌合基 因引入到一种异源豆科植物百脉根中，结果在未感染根瘤菌的 转基因植株的任何组织中都未检测到表达；但当转基因百脉根 植株的根用根瘤菌感染时，在根瘤发育的特定阶段（此时豆血 红蛋白被正常诱导）检出了高水平的CAT表达。
3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达
该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的 表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源 基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λ cI857
（2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的 复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞 中重组DNA的复制。
（三）、真核基因在原核细胞中的表达
存在困难： ①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。 ②ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除 后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞 的转录后加工系统。 ③在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖 核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转 录的mRNA缺少SD序列。 ④真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定， 容易被细胞蛋白酶所破坏。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光