外源基因的表达和转基因生物的鉴定.

异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
异源表达困难的原因：是因为不同物种 RNA聚合酶所识别 的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。
2、瞬时表达和稳定表达
瞬时表达（transient expression）：在受体中表达一个细胞 周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
稳定表达（stable expression）：转化的外源基因在细胞水平 可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且 可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。
3、组成型表达和发育特异性表达
组成型表达（constitutive expression）指表达是持续的， RNA及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变， 也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。
第二节 平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导 转化体表现其性状特征或生理特征。
二、细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断
外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中 应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会 损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测 特性。
（4）将外源蛋白分泌到周质或培养基中，就减少了外源蛋 白被蛋白水解酶降解的机会，可提高蛋白的回收率。
(2)存在于周质 由于周质中蛋白种类少，目标蛋白纯化较为简单； 蛋白酶解程度不甚严重；
促进二硫键的形成及蛋白质的折叠作用；
蛋白质N-末端结构真实。
（3）存在于胞外
蛋白质酶解作用最低； 目标蛋白容易纯化； 增进了蛋白质的折叠作用； 蛋白质N-末端结构真实。
（2）将纯化的融合蛋白进行化学或酶法裂解后，再上同 样的亲和层析柱，此时融合伙伴蛋白或亲和柄吸附到柱上， 而流出液则含有纯化的目标蛋白。
2、外源蛋白的分泌表达 外源蛋白可能积累的方式有三种，即出现于细胞质、周质 及细胞外培养基中。 （1）存在于细胞质 容易形成包含体，蛋白质已经折叠了，纯化后再折 叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性。
3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达
该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的 表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源 基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λ cI857
（2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的 复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞 中重组DNA的复制。
外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处：
（1）可以简化发酵后的纯化工艺。
（ 2）保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构。在大肠 杆菌中表达的外源蛋白很多都保留有N端的Met，Met的存在就 可能影响到表达蛋白的生物活性或免疫原性。通过基因设计， 就可以去除Met。
（3）外源蛋白生物活性的高低，依赖于蛋白的正确折叠，而 分泌表达设计，有利于正确构象的形成。
质粒拷贝数对细胞生长速率的影响
带有质粒的大肠杆菌HB101 无 A B 质粒拷贝数 0 12 24 相对生长速率/% 1.00 0.92 0.91
C
D E
60
122 408
0.87
0.82 0.77
三、外源基因在植物中的表达
1、同源性表达和异源性表达
同源性表达（homologous expression）指来源于相同物种 的基因（即来源于植物基因）在植物受体细胞中的表达 。
第八章 外源基因的表达和转 基因生物的鉴定
第一节
外源基因在受体中的表达
一、外源基因在受体中表达的一般特征
（一）原核基因在原核细胞中的表达
转录：需强启动子 翻译：（1）起始密码子 （2）SD序列
（二）真核基因在真核细胞中的表达
只要外源基因与受体组织具有相同的基因表达系统， 就可在宿主细胞中表达，更确切地说，只要外源基因 具有真核基因特有的启动子及其它控制序列，则它们 就能正常表达。
（三）、真核基因在原核细胞中的表达
存在困难： ①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。 ②由于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除 后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞 的转录后加工系统。 ③在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖 核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转 录的mRNA缺少SD序列。 ④真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定， 容易被细胞蛋白酶所破坏。
4、条件诱导表达
（1）热诱导表达 某些植物（如大豆、玉米等）暴露在高温下（通常在35℃ 以上）细胞可在1～3小时内合成一些新的蛋白质或增大特 异蛋白质的合成量。若将植物放回正常温度下，正常的蛋 白质合成可以在30分钟内恢复。 （2）共生细菌诱导表达
豆血红蛋白是由一组基因编码的，在大豆中现已找到4个含有 该蛋白质编码序列的连锁区段，其中包括4个正常基因（1ba， lbcl，1bc3）和1个假基因。将大豆血红蛋白1bc3基因的5′和 3′区段连接到编码CAT通告酶的编码序列上，再将此嵌合基 因引入到一种异源豆科植物百脉根中，结果在未感染根瘤菌的 转基因植株的任何组织中都未检测到表达；但当转基因百脉根 植株的根用根瘤菌感染时，在根瘤发育的特定阶段（此时豆血 红蛋白被正常诱导）检出了高水平的CAT表达。
（四）原核基因在真核细胞中的表达
原核基因在真核细胞中的表达主要是表达产物的剂量 问题，剂量较少又是因为原核基因组和真核基因组的 结构特征有差异，因而有表达障碍。
二、原核细胞高效表达外源基因
1、形成融合蛋白 N端：由原核DNA序列编码，
融合蛋白
C端：由真核DNA的完整序列编码。
可以通过两步亲和层析来进行纯化： （1）将含有融合蛋白的粗制样品，通过特定的亲和层析柱， 使融合蛋白和柱上的配基进行亲和作用而吸附到层析柱上， 将杂蛋白洗净后，再将融合蛋白洗脱下来。