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源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物；（2）内切酶消化处理模板；（3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
三重同源重组示意图
cry1Ac的启动子片段和终止子片段“一步”重组入pHT315质粒上

RedET同源重组技术概述

RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。

该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。

本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。

RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。

酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。

在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。

RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。

该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。

RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。

然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。

最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。

RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。

首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。

其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。

此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。

然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。

首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。

其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。

此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。

Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文

Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。

为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。

然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。

1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。

1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。

当配对成功后，RecA蛋白脱落。

或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。

当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。

至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。

但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。

2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。

Red同源重组技术研究进展

Red同源重组技术研究进展Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院⽣物⼯程研究所北京 100071 2沈阳药科⼤学沈阳 110016)摘要伴随着分⼦⽣物学的发展,⼀种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应⽤于⼤肠杆菌基因⼯程研究。

Red 重组系统由三种蛋⽩组成:E xo 蛋⽩是⼀种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产⽣3 突出端;Beta 蛋⽩结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退⽕;Gam 蛋⽩可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。

Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率⾼的特点。

这种技术可在DNA 靶标分⼦的任意位点进⾏基因敲除、敲⼊、点突变等操作,⽆需使⽤限制性内切酶和连接酶。

此外,这种新型重组技术可直接将⽬的基因克隆于载体上,⽬的基因既可来源于细菌⼈⼯染⾊体也可是基因组DNA 。

Red 同源重组技术使难度较⼤的基因⼯程实验顺利进⾏,⼤⼤推动功能基因组研究的发展。

关键词 Red 同源重组基因打靶基因⼯程收稿⽇期:2003 08 05 修回⽇期:2003 11 03*通讯作者,电⼦信箱zhangweicai@/doc/c711836424.html同源重组是基因⼯程实验中常⽤的技术⼿段,在基因打靶和基因克隆⽅⾯具有重要作⽤。

常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚⾄更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中⼤量重复序列的存在,⽽导致意外重排现象的发⽣。

B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有⼒⼯具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,⼤⼤限制了对⼤⽚段基因功能的研究。

近⼏年来,⼀种基于噬菌体Red 重组酶作⽤的同源重组技术逐渐成为基因⼯程研究的热点之⼀,并取得了⼀系列重要进展。

Red 同源重组技术的原理是将⼀段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR ⽚段导⼊宿主菌细胞,利⽤噬菌体Red 重组酶的作⽤,使导⼊细胞的线性DNA ⽚段与染⾊体(或载体)的特定靶序列进⾏同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所⽰)。

实验93RedET同源重组XXXX325.pptx

力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的制备
重组子筛选
重组产物转化至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：（1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5’端突出序列的同源序列。（2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活DNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体

red同源重组操作流程

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RedET同源重组技术概述(PPT 49页)

Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法

RedET同源重组技术概述(PPT 49页)

• 染色体的遗传差异主要由两种机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物；（2）内切酶消化处理模板；（3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式；利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法：采用“线性DNA+线性DNA”重组方式；利用RecE/RecT重组酶系统；减低质粒拷贝数。

red同源重组步骤

Red同源重装步骤1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。

(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。

(2)实验准备①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油(3)实验操作①化学转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置30min；3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。

6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。

②电击转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置2-3min；3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。

5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。

2.red同源重组电击感受态制备(1)实验准备①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。

②灭菌：1)活化培养基25ml（1mL*3*2）2)50*2感受态培养基3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器4)100ml左右去离子水5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4③试剂：1)Amp 抗生素（）2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。

同源重组的应用专题讲义PPT(20张)

◆ 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和 iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 ◆基因敲除和敲进的原理都是同源重组，即同源双交换，用克隆的外源基因取代基因组中野生型等位基因。 ◆两者不同点在于，基因敲除导入的外源基因是失活的、无功能的基因，基因敲进导入的是有活性和功能的基因。因而两者的具体用途有所不同。 ◆基因敲除和敲进都可用于基因功能的研究，基因敲进则也可用于突变基因的修复。
一、转基因动物 ◆转基因动物是把外源基因导入
动物的生殖细胞中，并整合该
细胞后发育成为个体整合的外源基因，整合的外源基因又能影响其后代遗传的动物。
转基因动物生产药用蛋白的基本过程
药用蛋白基因→表达细胞株→细胞核受体动物
供体动物→受精卵→无核受精卵→组装的核细胞→多细胞胚胎→假孕
动物→动物幼崽→雌性转基因动物→乳汁→药用蛋白
同源重组的应用 09生工夏章传
同源重组概述同源重组（homologous recombination） ◆即一般重组，是染色体之间进行遗传信息的方式之一，几乎所有生物都发生同源重组。 ◆如真核生物减数分裂中染色体的交换，细菌结合、转化、普遍性转导的遗传重组都属于同源重组。 ◆同源重组要求两个DNA分子的序列同源，同源区越长越有利于重组；同源区太短，则难于发生重组。因为它依赖于大范围 DNA同源顺序的联会，负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列特异性，只要两条DNA序列相同或相近，重组便可以在联会部分的任何位置发生。当然，也存在重组热点，即某些序列发生重组的概率高于其它序列。 ◆同源重组也是对损伤DNA修复的一种重要途径，即重组修复。

实验同源重组PPT讲稿

λ噬菌体的pL操纵子示意图来自l phagegba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
实验同源重组课件
内容
一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持
一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异

Red重组技术

Red重组技术2006-11-6 20:48最佳答案伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究.Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5'端向3'端降解DNA,产生3'突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性.Red同源重组技术具有同源序列短(40～60 bp)、重组效率高的特点.这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶.此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA.Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展.当今生物学与医学科学中，最强大的工具之一就是人工除去或补充DNA片段到生物体基因组中的能力。

这个能力已帮助科学家了解了许多由于基因缺陷引起的问题，如今基因缺陷已与数千种疾病联系在一起。

迄今这种增删DNA的技术还只局限于小DNA片断。

但4年前，德国海德堡欧洲分子生物学实验室的Francis Stewart和他的同事发明了一种可以改造细菌中更长片段的DNA的新技术（http://www-db.embl-heidelberg.de/jss/servlet/de.embl.bk.wwwTools.GroupL eftEMBL/ExternalInfo/stewart/ETcloning-textonly.html,）。

现在德国生物技术大学工作的原欧洲分子生物学实验室研究人员又用这一个方法改造了一个小鼠基因，使其产生一系列复杂变化，目的是能对人类的白血病有更多了解。

他们的研究结果发表在最新一期的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）上。

red同源重组基因敲除原理与步骤

red同源重组基因敲除原理与步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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实验93RedET同源重组2015325

“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等；
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
• 染色体的遗传差异主要由两种机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。