细菌内毒素和热原检查法讲解
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的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生
凝集反应的灭菌注射用水。
实验用具
移液管（或刻度吸管，定量移液 器）、凝集管（ 10 × 75mm）、三角瓶、 小试管（16×100mm）、试管架、洗耳 球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱 脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃 器皿须经 180 ℃干烤至少 2 小时。塑料 用具应使用其它适宜的除细菌内毒素 方法。
热原分类——按检查法分
内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原
热原检查法（家兔法）可用于检测 上述两种原因产生的热原反应。 细菌内毒素检查法只检测产品的细 菌内毒素含量。
试验验证未发现输液器材料的致热 性，临床发生的热原反应均为细菌内毒 素污染造成的。因此对输液器成品可采 用细菌内毒素检查法进行热原初试。
因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必
须是统一且标准的。
实验试剂
细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌 提取精制得到的内毒素，单位：EU.
用于标定细菌内毒素工作标准品和标定， 仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素 国家标准品为基准进行标定，确定其效 价。具备均一性和稳定性。
细菌内毒素检查用水： 指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度
某些材料释放热原质，作用于动物体 单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促
使其产生内生性热原，作用于下丘脑
体温调节中枢，结果使动物体温升高。
热原反应给临床治疗带来极大的危害， 一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即 会出现高热症状，反应严重者会造成死亡， 故必须严格控制。
细菌内毒素的理化性质
1 耐热性：180~200摄氏度2小时干热可 完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。）
实验目的：
据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的机理，以判断医疗器械或其浸 提液中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法，医疗器械/材料须经热 原实验评价证实无材料致热性，同时 经测定证实样品对细菌内毒素试验无 干扰作用后，才能采用该方法。
实验原理
细菌内毒素在钙离子，镁离子参
与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因 子激活b因子，活化的b因子激活凝固 酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成 凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱
中烘干备用 。
鲎试剂灵敏度复核
内毒素标准溶液的制备 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶 底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 75% 酒精 棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的 BET 水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。 置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需 浓 度 的 细 菌 内 毒 素 标 准 溶 液 即 2 . 0 λ 、1.0 λ ,0.5 λ , 0.25λ （λ 为所复核鲎试剂的标 示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上 混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。
试剂
75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
操作方法
试验准备 洗液的配备 配制铬酸洗液或其他适宜 的细菌内毒素灭活剂。 玻璃器皿的洗涤 将洗涤的玻璃器皿用 洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗 液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余 的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥 后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。
内毒素 C因子 活化c因子
某些非热原物 质 G因子
B因子
活化b因子
活化g因子
凝固酶元 凝固蛋白原
凝固酶
凝固蛋白 凝胶
实验试剂：
鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低 温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的
生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效
浓度表示。
wenku.baidu.com鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，
除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素， 玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤
箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少 2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自
然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两
周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源
性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中
细菌内毒素检查法
概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今
仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效
的方法，其优点在于：
1 科学性：有生物化学的理论基础。 2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性 高，重现性强。 3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵
敏度极高，
当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们 都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对 鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 4 实用性：方法快速，操作简单，无 需特殊仪器设备，经济实用。 由于细菌内毒素检查法的优越性，已 被广泛应用于临床检验。
细菌内毒素和热 原检查法
郝树彬
基础知识 热原：注入人体后可引 起发热反应的物质。
1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。
热原的检查方法
体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942 年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使 用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原 检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热 原。
热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。 细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。
热原的致热机理：细菌内毒素，
病毒，细菌及其他微生物，类固醇或
2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。
3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水 冲洗以除去热原。 4 不挥发性
5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。
6 被酸碱破坏 7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时， 可完全破坏。
细菌内毒素生物活性
致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细胞 与鲎试剂反应
凝集反应的灭菌注射用水。
实验用具
移液管（或刻度吸管，定量移液 器）、凝集管（ 10 × 75mm）、三角瓶、 小试管（16×100mm）、试管架、洗耳 球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱 脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃 器皿须经 180 ℃干烤至少 2 小时。塑料 用具应使用其它适宜的除细菌内毒素 方法。
热原分类——按检查法分
内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原
热原检查法（家兔法）可用于检测 上述两种原因产生的热原反应。 细菌内毒素检查法只检测产品的细 菌内毒素含量。
试验验证未发现输液器材料的致热 性，临床发生的热原反应均为细菌内毒 素污染造成的。因此对输液器成品可采 用细菌内毒素检查法进行热原初试。
因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必
须是统一且标准的。
实验试剂
细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌 提取精制得到的内毒素，单位：EU.
用于标定细菌内毒素工作标准品和标定， 仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素 国家标准品为基准进行标定，确定其效 价。具备均一性和稳定性。
细菌内毒素检查用水： 指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度
某些材料释放热原质，作用于动物体 单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促
使其产生内生性热原，作用于下丘脑
体温调节中枢，结果使动物体温升高。
热原反应给临床治疗带来极大的危害， 一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即 会出现高热症状，反应严重者会造成死亡， 故必须严格控制。
细菌内毒素的理化性质
1 耐热性：180~200摄氏度2小时干热可 完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。）
实验目的：
据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的机理，以判断医疗器械或其浸 提液中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法，医疗器械/材料须经热 原实验评价证实无材料致热性，同时 经测定证实样品对细菌内毒素试验无 干扰作用后，才能采用该方法。
实验原理
细菌内毒素在钙离子，镁离子参
与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因 子激活b因子，活化的b因子激活凝固 酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成 凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱
中烘干备用 。
鲎试剂灵敏度复核
内毒素标准溶液的制备 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶 底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 75% 酒精 棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的 BET 水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。 置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需 浓 度 的 细 菌 内 毒 素 标 准 溶 液 即 2 . 0 λ 、1.0 λ ,0.5 λ , 0.25λ （λ 为所复核鲎试剂的标 示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上 混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。
试剂
75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
操作方法
试验准备 洗液的配备 配制铬酸洗液或其他适宜 的细菌内毒素灭活剂。 玻璃器皿的洗涤 将洗涤的玻璃器皿用 洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗 液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余 的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥 后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。
内毒素 C因子 活化c因子
某些非热原物 质 G因子
B因子
活化b因子
活化g因子
凝固酶元 凝固蛋白原
凝固酶
凝固蛋白 凝胶
实验试剂：
鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低 温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的
生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效
浓度表示。
wenku.baidu.com鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，
除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素， 玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤
箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少 2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自
然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两
周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源
性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中
细菌内毒素检查法
概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今
仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效
的方法，其优点在于：
1 科学性：有生物化学的理论基础。 2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性 高，重现性强。 3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵
敏度极高，
当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们 都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对 鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 4 实用性：方法快速，操作简单，无 需特殊仪器设备，经济实用。 由于细菌内毒素检查法的优越性，已 被广泛应用于临床检验。
细菌内毒素和热 原检查法
郝树彬
基础知识 热原：注入人体后可引 起发热反应的物质。
1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。
热原的检查方法
体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942 年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使 用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原 检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热 原。
热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。 细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。
热原的致热机理：细菌内毒素，
病毒，细菌及其他微生物，类固醇或
2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。
3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水 冲洗以除去热原。 4 不挥发性
5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。
6 被酸碱破坏 7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时， 可完全破坏。
细菌内毒素生物活性
致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细胞 与鲎试剂反应