细菌内毒素和热原检查法讲解
细菌内毒素检查讲解
（3）供试品阳性对照液（B）的制备 取1.0ml供试品，加入1.0ml上述C溶液即得。 （4）阴性对照（D）的制备
直接使用BET水。
取8只鲎试剂，分别加0.1mLBET复溶，在分别加入A、 B、C、D组溶液各0.1mL （每组2管） 。加样结束后，用 封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入
37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察并记录结果。
利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的 现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否 符合规定的一种方法。
旋涡混合器 鲎试剂（λ=0.5EU/ml） 恒温水浴器（37℃±1℃） 细菌内毒素工作标准品 精密移液枪 无热原吸头（100μL、 1mL） （CRE，10EU） 细菌内毒素检查用水（BET） 安瓿架 封口膜 5%葡萄糖注射液 脱脂棉和无菌纱布 标签纸和记号笔 剪刀 表
供试品细菌内毒素的检查
按下表制备溶液A、B、C和D。
编号 A 内毒素浓度/配制内毒素 的溶液 无/供试品溶液 平行管 数 2 供试品溶液
B
C
2λ/供试品溶液
2λ/检查用水
2
2
供试品阳性对照
阳性对照
D
无/检查用水
2
阴性对照
（1）供试品溶液（A）的配制
取供试品1.0ml，加入1.0ml的BET水，即得供试品溶 液。 （2）阳性对照液（C）的配制 用BET水将CSE制成 2λ浓度的内毒素溶液。
供试品Leabharlann 供试品阳性对照阳性对照阴性对照
1号 2号
结果是否有效 结果判断
1号 2号
1号 2号
1号 2号
思考题
（1）试验设置阳性对照、阴性对照的意义是什么？ （2）试验中如果出现阴性对照为阳性，该如何处理？ （3）供试品阳性对照液如何配制？
注射剂热原和细菌内毒素检查
1→3-β-D葡聚糖
B因子
活化B因子 活化G因子
G因子
前凝固酶
凝固酶(显色基质法)
凝固蛋白原
凝固蛋白
(比浊法,凝胶法)
鲎试剂凝集反应过程
二.热原和细菌内毒素检查方法
（一）.四国药典比较
❖ 热原：家兔体重（无上限），初温，测定 次数，结果判断
❖ 细菌内毒素：方法，标准品（保存时间）， 检查用水（限值），试验准备（除热原， PH），检查限值，关于0.5~2.0的范围
中国药典部分注射剂计算限值与规定限值差异
品名 人最大用量 计算限值 规定限值
❖ 5%葡萄糖 5ml/kg.h 1EU/ml 0.5EU/ml
❖ 50%葡萄糖 1ml
5 (10EU/g) 0.5
❖ 两性霉素B 0.16mg 30EU/mg 15EU/mg
❖ 青霉素钾(钠)16万IU 0.00003EU/IU 0.0001
克林霉素
0.1
0.58
（四）.2005版检查品种的增加研究
❖ 1).拟定了中美英药典热原内毒素对照表
化学药品约120种，生物制品约35种，根据 人用最大剂量参考热原和国外药典，初步 确定内毒素限值。
❖ 2).分工研究，化学药品146种，确定了研究 的指导原则，28家药检所负责
❖ 3).试验结果
❖ ①多数品种比较一致，用0.125～0.5EU/ml 灵敏度可以进行限值检测
❖ ②有的品种需要用0.03～0.06EU/ml才可检 测（肝素钠，放线菌素D等）
❖ ③少数品种不干扰浓度相差较大 抑肽酶 0.75u/ml 14u/ml 妥布霉素 0.5mg/ml 0.125mg/ml 丝裂霉素 1mg/ml 0.0125mg/ml 葡萄糖酸钙注射液 0.3125mg/ml；5mg/ml 氯唑西钠 5mg/ml 1.25mg/ml
《细菌内毒素检查》课件
其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
细菌内毒素检查法讲稿
活化得C因子 活化得B因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原
凝固蛋白(凝胶)
13
1、凝胶法实验原理
37± 1℃下保温反应602分钟 当样品中细菌内毒素得浓度达到或超过鲎试剂
得灵敏度时,凝集为坚实凝胶,为阳性,记为“+”。 当样品中细菌内毒素得浓度未达到鲎试剂得灵
敏度时,不能凝集为坚实凝胶,为阴性,记为“— ”。
内毒素
二价阳离子
C因子
活化得C因子
B因子
活化得B因子
凝固酶原
β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM
活化得G因子
G因子
凝固酶
凝固蛋白(凝胶)
凝固蛋白原
能与鲎得血液提取物可发生发生多级酶促反应,形成凝胶 5
细菌内毒素检查法反应机理
在药品生产质量管理规范(GMP)条件下进行药 品生产得质量控制,一般可以接受得观点就是, 不存在内毒素就意味着不存在热原
8
二、细菌内毒素检查法介绍
细菌内毒素检查包括:
限量实验
凝胶法
光度测定法
半定量实验
浊度法 动态浊度法 终点浊度法
显色基质法 动态显色法 终点显色法
可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果 有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。
9
细菌内毒素检查 凝胶法
10
细菌内毒素检查----------凝胶法
鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度c= 0、125EU/ml÷0、15EU/mg=0、833mg/ml
33
细菌内毒素检查----------凝胶法
2、实验部分 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验:预实验
正式干扰实验 检 查 法:限量试验
半定量试验
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
热原检查法
实验动物的选择
—
体重
性别
条件
饲养温度 试验温度
中国药典
＞1.7kg
不限，雌兔 应无孕
使用7天预养期未见异常的未试
动物，或已试的符合热原规定的 动物。
美国药典
≥2.0kg
不限，雌兔 不使用3天内已试动物，不使用 应无孕 热原试验不合格的动物。
17-25℃ 变化≤3℃
20-23℃ 选定温度 ±3℃
英国药典 ≥1.5kg 不限，雌兔 应无孕
新方法国内研究现状
国内对新方法的研究与国际相比有一定差距， 2010版中国药典未收录新热原检测方法。 国家药典委员会已经启动了体外热原检查法 的课题.
已开展的研究方法
兔新鲜全血法 鼠新鲜全血法 人新鲜全血法 人冻存全血法 PBMC细胞法
感谢聆听！
第三组：王雅静、吴显婷、郭帅、祁宇
时间：2017年4月
20-23℃ 变化≤3℃
—
中国药典
时间
3-7天
给药
N
美国药典 7天内
N
测量次数
选择条件
8次 30min/次
8次体温均在38.0-39.6℃之间， 且最高与最低体温相差≤0.4℃，
个体间体温差≤1℃
8次 30min/次
体温不超过39.8℃，个体间体 温差≤1℃
英国药典
1-3天
10ml/kg生
10次
体温在38.0-39.8℃之间，个体
理盐水 30min/次，舍
（38.5℃）
去前2次
间体温差≤1℃
注意事项
1. 抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。 2. 在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室
细菌内毒素检测方法介绍
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节 肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及 两广的沿海一带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解 液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种 细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成 特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程 度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的 敏感试剂。
平行 管数
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
0.25 0.125 0.06 0.03
NC
反应终 点浓度C
X (lgC)
1
+
+
+
- - 0.06 -1.22
2+
+
-
- - 0.125 -0.903
3+
+
-
- / 0.125 -0.903
4+
+
-
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
外源性 热原质
吞噬性 白细胞
内源性 热原质
新蛋白 合成
新mRNA 翻译
体温调节 中心
发热
1942年，美国药典首次收载热原检查法，中 国药典自第一版（1953年版）起收载。
所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都 要经过热原检查。
热原检查法的局限性：
1、重现性差。 2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。 3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。 4、非定量反应。
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔
试剂
1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号
细菌内毒素检查法
移取注射液xml
MVD？
L· x/v=L×MVD ≥入,MVD≥入/L EU/ml
3.检查方法
（1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素）
②确定药品的细菌内毒素限值L； ③选择鲎试剂的灵敏度入；
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 该法优点：快速、灵敏。 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂
①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
c lg 1 ( X / 4)
复溶
内毒素检查用水
4支 4支
0.5λ 内毒素溶液 保温1h
结 果 有 效
2支
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒 素检查，并以λC 为该批鲎试剂灵敏度
呈阴性
18
式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是 指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
（4）取鲎试剂8支（0.1ml/支），两支作为样品检 查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产 品对照，2支标记为阴性对照，如下图所示
s1 s2 阳性对照 阳性产品对照 阴性对照
0.1ml水 0.1ml水 +0.1ml +0.1ml SMVD16 SMVD16
0.1ml水 +0.1ml E2入
3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
细菌内毒素检测
1
概述
前言
细菌内毒素
一、前言
热源检查易受试验动物个体差异、方法灵敏度、 药物本身性质的影响，受到一定限制，与家兔 热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度 低，实验成本小等特点，还可以通过对原料、 活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的 细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明 显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能 污染的痕量内毒素，为区分干扰作用与内毒素 污染提供了极为重要的技术手段。
干扰无法去除 选择其他方法
2006年6月 山东省药品检验所 26
1 内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素 限值要求？样品的内毒素含量是多少？与前 一批的结果比较相差多少？与内毒素限值含 量相差多少？ 这些问题不但关注用药安全，同时也考虑了 生产环境的内毒素含量变化。 因此，一个完善的细菌内毒素检查法的建立， 除了要满足法规相关的强制性要求，保证临 床用药人群的安全外，还应该最大限度的提 供有关内毒素含量的信息，为药品生产过程 的质量控制提供警戒信息。
2006年6月
山东省药品检验所
22
三、方法学验证注意事项 一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法 验证实验一般应注意：首先要了解产品的 溶解度，按照适当的临床用量确定合适的 内毒素限值，并确证产品对方法是否存在 干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈 的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法 不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。
2006年6月
山东省药品检验所
9
3 鲎试剂凝胶反应的特征
⑴随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不 断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会 增加。 ⑵内毒素的浓度决定了光密度增加的速 率。 ⑶凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的 平台期、快速增长期和后期的平台期）。 这些特性构成了各种检测方法的理论基 础。
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查的关系前面看到过关于无菌和内毒素区别的帖子。
那么请问各位，热源、无菌、细菌内毒素和微生物限度检查究竟有什么区别，又有什么联系呢？本人我在微生物方面比较白，只是觉得这四项都和细菌有关，都需要培养基，都要在无菌台里做…… 汗~~ 其他的实在不知了。
头都大了，希望各位指点迷津，谢谢。
[楼主] | Posted:08-09-09 10:22|珊瑚礁级别: ★会员发帖: 292威望: 6财富: 95注册时间:2008-03-06最后登陆:2010-11-25无菌，最终灭菌产品和百级生产非灭菌产品需要检测的项目，一般采用薄膜过滤法；如，粉针剂、大输液产品。
微生物限度，允许结果有菌落，但有限度，是一定范围，一般采用半封闭薄膜过滤法和平皿法。
指非灭菌产品，如口服制剂和食品、外用药。
热源，目前很多品种采用细菌内毒素检测方法代替，简单，成本低。
但必须按照国家标准。
内毒素和热源一般是大输液产品的检测项目。
想了解很多，应该多看看专业书籍啊[1 楼] | Posted:08-09-09 12:21|洲际捣蛋级别: 论坛版主发帖: 2500威望: 315财富: 42注册时间:2008-03-15最后登陆:2010-11-08热原---不需要培养基兔法看药典就知道是怎么回事了细菌内毒素----不需要培养基一般工作环境也可以做无菌----需要培养基薄膜过滤法直接接种法也可以参照药典微生物限度检查----需要培养基薄膜过滤法梯度稀释图布平板法区别：热原和细菌内毒素检验方法的不同但检验的东西在本质上其实是一样的另外细菌内毒素检查法要比热原检查法灵敏10倍，根据各种药物的特性，规定检查热原还是细菌内毒素。
注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-10-11zyb3421060级别: ★会员发帖: 65威望: 3财富: 1注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-11-12还不是很明白[5 楼] | Posted:08-12-25 08:26|shabb007级别: ★★会员发帖: 649威望: 20财富: 20注册时间:2007-12-14最后登陆:2010-12-03这么说吧。
1142热原检査法
表 2-2 耳 用 制 剂 、鼻 用 制 剂 、库 肤 给 药 制 剂 、 吸入制剂抑菌效力判断标准
A 细菌
B
A 真菌
B
减 少 的 lg 值
2d
7d
14d
28d
2
3
—
NI
—
—
3
NI
—
一
2
NI
—
—
1
NI
注 ：N I : 未 增 加 ，是 指 对 前 一 个 测 定 时 间 ，试 验 菌 增 加 的 数 量 不 超 过 0. 5 lg 。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细 菌 内 毒 素 的 量 用 内 毒 素 单 位 （E U )表 示 ，1 E U 与 1 个 内 毒 素 国 际 单 位 （I U ) 相 当 。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成， 用 于 标 定 、复 核 、仲 裁 鲎 试 剂 灵 敏 度 、标 定 细 菌 内 毒 素 工 作 标 准 品 的 效 价 ，干 扰 试 验 及 检 查 法 中 编 号 B 和 C 溶 液 的 制 备 、凝 胶 法 中 鲎 试 剂 灵 敏 度 复 核 试 验 、光 度 测 定 法 中 标 准 曲 线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基 准 标 定 其 效 价 ，用 于 干 扰 试 验 及 检 查 法 中 编 号 B 和 C 溶液 的 制 备 、凝 胶 法 中 鲎 试 剂 灵 敏 度 复 核 试 验 、光 度 测 定 法 中 标 准曲线可靠性试验。 细 菌 内 毒 素 检 查 用 水 应 符 合 灭 菌 注 射 用 水 标 准 ，其内毒 素 含 量 小 于 0_ 015EU/ml( 用 于 凝 胶 法 ）或 0. 005EU/ml(用 于 光 度 测 定 法 ），且 对 内 毒 素 试 验 无 干 扰 作 用 。 试验所用的 器皿需经 处理，以去除可能存在的外源性内 毒 素 。耐 热 器 皿 常 用 干 热 灭 菌 法 （250°C、3 0 分 钟 以 上 ）去 除 ，也 可 采 用 其 他 确 证 不 干 扰 细 菌 内 毒 素 检 査 的 适 宜 方 法 。 若 使 用 塑 料 器 具 ，如 微 孔 板 和 与 微 量 加 样 器 配 套 的 吸 头 等 ， 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供 试 品 溶 液 的 制 备 某 些 供 试 品 需 进 行 复 溶 、稀释或在 水 性 溶 液 中 浸 提 制 成 供 试 品 溶 液 。必 要 时 ，可调节被测溶液 ( 或 其 稀 释 液 ）的 p H 值 ，一 般 供 试 品 溶 液 和 鲎 试 剂 混 合 后 溶 液 的 p H 值 在 6 .0 〜 8 .0 的 范 围 内 为 宜 ，可 使 用 适 宜 的 酸 、 碱 溶 液 或 缓 冲 液 调 节 p H 值 。酸或碱 溶 液 须用 细 菌 内 毒 素 检 査 用 水 在 已 去 除 内 毒 素 的 容 器 中 配 制 。缓 冲 液 必 须 经 过 验 证 不含内毒素和干扰因子。 内毒 素 限 值 的 确 定 药 品 、生 物 制 品 的 细 菌 内 毒 素 限 值 (L )一般按以下公式确定：
热原与细菌内毒素的异同点
热原与细菌内毒素的异同点生活中经常有朋友问我，你在药检所是干什么的？我的回答往往是：我是做热原和细菌内毒素的。
朋友们丈二和尚摸不着头脑，待我给他一番详细解释之后，还是很难分清热原和细菌内毒素到底有什么不同。
其实，不仅一般普通人无法轻易分清它们，就是好多药检所的同事们也有此疑问，它们到底一样不一样呢？下面我将尽我所能的把二者之间的区别和联系以通俗易懂的语言展现给大家。
热原就是由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
细菌内毒素是细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。
一般来说内毒素是热原,但热原不全是内毒素。
严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。
在（）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。
热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查法，具有较家兔热原检查法灵敏、快速、简便易行、重现性好、结果准确等优点，目前细菌内毒素检查法已广泛应用于西药、生物制品，在《中国药典》2010年版二部、三部内全面应用，但在《中国药典》2010年版一部（中药注射剂）内一个药品都未运用，这主要是因为细菌内毒素检查是一个复杂的酶促反应过程，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加，然而现有的中药注射剂，具有成分复杂、影响因素多的特点，因此，中药注射剂一般还是采用传统的家兔热原检查法。
但是对一些具有解毒降温作用的药物，因会干扰家兔的生理活性，引起体温下降，用家兔法检测不准，还是应考虑用细菌内毒素检查法。
热原和细菌内毒素的区别
热原和细菌内毒素一、热原(progon)医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。
为提高药品质量和用药安全，人们对热原进行了广泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔检测热原的方法。
在1942年美国药典首先将家兔热原检查项收入药典成为法定方法，中国药典1953年版开始收载该方法，随后的世界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的方法之一。
家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。
所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。
这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。
其缺点：①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。
②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。
③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。
④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要几百元/次，而鲎试剂仅几十元/次。
综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命。
什么是热原？目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素的脂多糖。
欧洲药典委员会副主席J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。
在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。
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细菌内毒素检查法
概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今
仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效
的方法，其优点在于：
1 科学性：有生物化学的理论基础。 2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性 高，重现性强。 3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵
敏度极高，
当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们 都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对 鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 4 实用性：方法快速，操作简单，无 需特殊仪器设备，经济实用。 由于细菌内毒素检查法的优越性，已 被广泛应用于临床检验。
细菌内毒素和热 原检查法
郝树彬
基础知识 热原：注入人体后可引 起发热反应的物质。
1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。
热原的检查方法
体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942 年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使 用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原 检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热 原。
内毒素 C因子 活化c因子
某些非热原物 质 G因子
B因子
活化b因子
活化g因子
凝固酶元 凝固蛋白原
凝固酶
凝固蛋白 凝胶
实验试剂：
鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低 温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的
生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效
浓度表示。
鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，
试剂
75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
操作方法
试验准备 洗液的配备 配制铬酸洗液或其他适宜 的细菌内毒素灭活剂。 玻璃器皿的洗涤 将洗涤的玻璃器皿用 洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗 液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余 的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥 后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。
热原分类——按检查法分
内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原
热原检查法（家兔法）可用于检测 上述两种原因产生的热原反应。 细菌内毒素检查法只检测产品的细 菌内毒素含量。
试验验证未发现输液器材料的致热 性，临床发生的热原反应均为细菌内毒 素污染造成的。因此对输液器成品可采 用细菌内毒素检查法进行热原初试。
某些材料释放热原质，作用于动物体 单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促
使其产生内生性热原，作用于下丘脑
体温调节中枢，结果使动物体温升高。
热原反应给临床治疗带来极大的危害， 一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即 会出现高热症状，反应严重者会造成死亡， 故必须严格控制。
细菌内毒素的理化性质
1 耐热性：180~200摄氏度2小时干热可 完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。）
实验目的：
据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的机理，以判断医疗器械或其浸 提液中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法，医疗器械/材料须经热 原实验评价证实无材料致热性，同时 经测定证实样品对细菌内毒素试验无 干扰作用后，才能采用该方法。
实验原理
细菌内毒素在钙离子，镁离子参
与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因 子激活b因子，活化的b因子激活凝固 酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成 凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。
3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水 冲洗以除去热原。 4 不挥发性
5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。
6 被酸碱破坏 7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时， 可完全破坏。
细菌内毒素生物活性
致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细表面可能存在的外源性内毒 素， 玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤
箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少 2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自
然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两
周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源
性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中
的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生
凝集反应的灭菌注射用水。
实验用具
移液管（或刻度吸管，定量移液 器）、凝集管（ 10 × 75mm）、三角瓶、 小试管（16×100mm）、试管架、洗耳 球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱 脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃 器皿须经 180 ℃干烤至少 2 小时。塑料 用具应使用其它适宜的除细菌内毒素 方法。
热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。 细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。
热原的致热机理：细菌内毒素，
病毒，细菌及其他微生物，类固醇或
因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必
须是统一且标准的。
实验试剂
细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌 提取精制得到的内毒素，单位：EU.
用于标定细菌内毒素工作标准品和标定， 仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素 国家标准品为基准进行标定，确定其效 价。具备均一性和稳定性。
细菌内毒素检查用水： 指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度
浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱
中烘干备用 。
鲎试剂灵敏度复核
内毒素标准溶液的制备 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶 底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 75% 酒精 棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的 BET 水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。 置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需 浓 度 的 细 菌 内 毒 素 标 准 溶 液 即 2 . 0 λ 、1.0 λ ,0.5 λ , 0.25λ （λ 为所复核鲎试剂的标 示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上 混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。