常用分子生物学技术的原理及应用最新版本

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实时PCR技术原理
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第三节
核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
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核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
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一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用
研究。
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其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱
基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强
度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分
子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的
DNA片段，将这些片段经电泳分离。
分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射 自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
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（二）定位克隆(positional cloning)
（三）非定位候选基因克隆策略(positionindependent candidate gene
approaches)
（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )
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（一）功能性克隆
第二十二章
常用分子生物学技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
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第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
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一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子
放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关 系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
利用酵母系统从功能精学品课角件 度鉴定致病基因。目 录
（二）定位克隆
定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步
缩小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作
① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析
染色体异常(缺失、易位等)分析、基
因文库的筛选与基因克隆 精品课件
定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，
克隆该致病基因。
应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得
到部分纯化的遗传性疾病。
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克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸 作探针，筛选cDNA文库。
功能互补试验 (functional complementation assay)
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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②
①
③
分子杂交实验
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放 射 自 显 影 照 片
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DNA 点阵
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第二节
聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
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一、基本工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
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四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
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三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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DNA自动测序结果举例
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第四节
基因文库
Gene Library
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基因文库 (gene library)
是指一个包含了某一生物体全部DNA 序列的克隆群体。 •基因组DNA文库 (genomic DNA library)
•cDNA文库 (cDNA library)
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（三）非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的 发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根 据病理学变化和对各种基因产物功能的了解， 预测出候选致病基因。
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基因组文库筛选结果举例
第一轮筛选
第二轮筛选
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第三轮筛选
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第五节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
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克隆疾病相关基因的策略
ห้องสมุดไป่ตู้
（一）功能性克隆(functional cloning)
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复性
RNA
DNA
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（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记
其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定
在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核
酸分子存在。
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二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分
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二、DNA链末端合成终止法
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三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物 经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四 种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并 依此确定DNA碱基的排列顺序。
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Cycle 2
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的
含量可以扩大100万倍以上。
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二、PCR体系基本组成成分
模板DNA
特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
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三、PCR的基本反应步骤