核酸分子杂交的种类及应用

核酸分子杂交

摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。

关键词:核酸分子;分类;应用;

1、核酸杂交技术的原理

核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。

核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。

2、固相分子杂交:

将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。

固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。

2、1 Southern印迹杂交

1975年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。再在凝胶上贴上硝酸纤维素膜,使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。然后直接在膜上进行核酸探针(已被同位素标记)与被测样品之间的杂交,再通过放射自显影对杂交结果进行检测[4]。

2、2 Northern印迹杂交

1976年Alwine建立了该方法。这就是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。其检测过程与Southern转移杂交基本相同,所不同的就是用DNA探针检测经凝胶电泳分开的RNA分子。它主要用于研究基因的转录活性及表达[5]。

2、3 Western印迹杂交

Western印迹就是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转移至到固相载体上,然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白,分析基因的表达程度。

固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分[6]。

2、4斑点杂交

将待测核酸样品进行DNA或RNA变性处理后,直接点在硝酸纤维素滤膜上,经烘烤固定后,与同位素或生物素标记的探针进行杂交,杂交后放射性双链DNA 可使X光胶片感光,形成自显影斑点。

2、5菌落原位杂交

将培养基上长出的菌落通过影印方法转移到硝酸纤维素膜上,碱变性破坏细菌的细胞壁使其释放出DNA,并经变性处理使双链DNA解链,经烘烤固定后,用同位素标记的探针进行杂交,最后放射自显影。如果底片上出现蝌蚪状黑点,即证明相应的菌落中具有与探针DNA同源的核酸片段。

3、液相分子杂交[5]

液相分子杂交就是将待测的核酸样品与同位素标记的DNA探针同时溶于杂交液中进行反应,然后分离杂交双链与未参加反应的标记探针,用仪器检测并计算分析杂交结果。

4、原位杂交

将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交,并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞定位或基因表达的检测技术。

5、应用

5、1基因诊断、传染病病原体的检测

核酸分子杂交具有很高的灵敏性与特异性,因而该技术目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断、恶性肿瘤的基因分析、传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促进了现代医学的进步与发展。例如,我们可以用DNA杂交技术来检测某人就是否感染了乙肝病毒(乙肝病毒的遗传物质就是DNA)。方法就是拿一个用荧光或同位素标记的DNA分子探针(这个探针就就是乙肝病毒DNA分子),如果被检测的DNA分子与探针杂交了,或者说杂交的部位非常多,则说明被测者感染了乙肝病毒;如果被检测的DNA与探针没有杂交,或者说杂交的部位非常少,则说明被测者没有感染乙肝病毒。

5、2在生物合成代谢研究中的应用

用逆转录酶可以在体外以mRNA为模板合成DNA,此种DNA称互补DNA(cDNA)。用cDNA作为探针,可以检测细胞中的mRNA。它的敏感性比直接测定蛋白质要高1000倍。以cDNA作为探针的原位杂交技术结合蛋白测定技术,可以了解单个细胞内mRNA的翻译水平,即蛋白质合成能力,从而可以了解组织器官的代谢与功能状态,以及器官组织内不同细胞群的功能差异,并能同时进行形态学观察。

参考文献

[1]、王平,核酸分子杂交技术及其应用[J]、井冈山医专学报、1996,3(2):15-17、

[2]、宋胜华、核酸分子杂交技术及其应用[J]、临床与实验病理学研究、1987,3(3):185-188、

[3]、尹与平,张世荃、简述核酸分子杂交技术[J]、生物学通报、1992,6:16-48、

[4]、易先平、核酸杂交技术及其在医学中的应用[J]、中国冶金工业医学杂志、1994,11(6):374-375

[5]、张玉研,核酸分子杂交技术简介[J]、细胞生物学杂志、1980,2(2):43-48、

[6]、黄凤珍、分子杂交技术的应用简述[J]、中学生物学,2009,25(9):11-13、