细胞免疫组化

细胞免疫组化

细胞爬片的免疫组化

1. 细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。

2. PBS 清洗标本3 次各1 min 。

3 .冰丙酮固定15 min（或4%多聚甲醛固定30min）。

4. 空气干燥5min 。

5. PBS 清洗标本3 次各2 min 。

6. 0.5%Triton X-100（ DPBS 配）孵育1 次20min 。

7. PBS 清洗标本3 次各2 min 。

8 .3%H2O2 （试剂A）孵育15 min。

9. DPBS 清洗标本3 次各2 min 。

10. 封闭血清孵育（试剂B）20min 。

11 .一抗孵育（滴度1: 200,湿盒）4C 过夜或37 C 60 min

阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS 液

12. PBS清洗标本3次各5 min。

13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37 C 30 min。

14 .PBS 清洗标本3 次各5 min。

15. 试剂D （湿盒）37 C 30 min。

16、PBS 清洗标本3 次各5 min 。

17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min 18、

蒸馏水洗2 次 1 min 。

19、苏木素复染0.5~1min 。

20、自来水洗返蓝。

21. 梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min 。

22. 二甲苯透明2 次3min 。

23、中性树胶封片。

注意事项：

1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：

a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞

爬片才较牢固冲洗时不易脱片；

b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂

质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。