从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较

检测进行定量分析，结果显示：水浴法比煮沸法的回收率高。水浴法结合乙醇沉淀法还具有经济和操作
简单的优点，可以广泛应用。
关键词：非变性聚丙烯酰胺凝胶；DNA 小片段；回收；纯化
中图分类号：Q7
文献标志码：A
论文编号：2011-0003
Comparative Study on Two Methods of Recycling Short DNA Fragments from Nondenaturing Polyacrylamide Gel
Zhang Lei, Yuan Ling, Huang Jian’an, Wu Wenliang, Chen Dongsheng, Liu Zhonghua
(Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University/National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanical, Changsha 410128)
从图 1 可看出，pBluescript II SK(+)—PPRE vector 用 Fast Digest KpnI 和 Fast Digest XhoI 双酶切后得到 了目的片段 PPRE（51 bp），表明此次双酶切反应成功， 验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶检测小片段 DNA 的可 行性；此次双酶切反应运用了 Fermentas 公司的快酶， 即 Fast Digest KpnI 和 Fast Digest XhoI，反应时间大大 缩短，省时省力，进一步验证了快酶的可行性；1 号和 2
摘 要：从聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNA 片段是分子生物学中的常用技术，尤其针对于 DNA 小片段的回
收。本试验对比了两种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNA 小片段的方法（煮沸法和水浴法），并用无
水乙醇和 3 mol/L 醋酸钠共沉淀纯化 DNA 小片段。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测回收结果，通过紫外
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号泳道中是同一样品，即 pBluescript II SK(+)—PPRE vector 用 Fast Digest KpnI 和 Fast Digest XhoI 双酶切后 的产物，两个泳道中条带位置和亮度基本一致；1 号和 2 号 泳 道 点 样 孔 处 均 有 一 条 较 亮 的 条 带 ，这 是 pBluescript II SK(+ ) —PPRE vector 经 Fast Digest KpnI 和 Fast Digest XhoI 双酶切后余下的条带，约为 2900 bp。 2.2 两种回收 DNA 方法的比较
（1）煮沸法：向保留有凝胶的 Eppendorf 管中加入 100 μL 双 蒸 水 ，用 枪 头 尖 将 凝 胶 碾 碎 ，100℃ 煮 沸 15 min。以 12000 rpm 离心 5 min 后，将上清液（DNA 粗回收液）移至一新的 Eppendorf 管中[9]。
（2）水浴法：向另一保留有凝胶的 Eppendorf 管中
M
1
2
500bp 200bp
100bp 80bp 60bp
40bp
20bp
M：20 bp DNA Ladder Marker；1：双酶切后的产物；2：双酶切后的产物
图 1 pBluescript II SK(+)—PPRE vector 双酶切后的 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图
章 蕾等：从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA 小片段的两种方法比较
加入 100 μL 双蒸水，用枪头尖将凝胶碾碎，37℃水浴 12 h。以 12000 rpm 离心 5 min 后，将上清液（DNA 粗 回收液）移至一新的 Eppendorf 管中[10]。 1.2.6 DNA 的纯化 于上清液（DNA 粗回收液）中加入 2 倍体积预冷的无水乙醇和 1/l0 体积 3 mol/L 的醋酸钠 （pH 5.2），-20℃放置 1 h；4℃，12000 rpm 离心 20 min， 吸弃上清；用 75%乙醇洗涤沉淀 2 次；4℃，12000 rpm 离心 2 min，吸弃上清；待乙醇挥发干净后，用双蒸水溶 解沉淀[11]。非变性聚丙烯酰胺凝胶检测（如图 2）。 1.2.7 PAGE 胶 电 泳 检 测 目 的 DNA 将 纯 化 回 收 的 DNA 样 品 加 入 等 体 积 Loading Buffer 充 分 混 合 ，取 8 μL 上样。以 20 bp DNA Ladder Marker 作为分子量 标准。上样后，于 120 V 恒电压电泳至第二条 loading Buffer 带至胶板的 2/3 处。用 0.5 μg/mL 溴化乙锭染 色，紫外检测。 2 结果与分析 2.1 目的 DNA 的获取
Abstract: Recycling DNA fragments from polyacrylamide gel is a common technique in molecular biology, especially for recycling DNA short fragments. In this experiment, two methods (boiling method and water-bath method) were used to extract short DNA fragments which were co-precipitated with absolute ethanol and 3 mol/ L sodium acetate together. The results were compared by polyacrylamide gel electrophoresis. At last, short DNA fragments was analyzed by the method of ultraviolet absorption. It showed that the recovery rate of short DNA fragments in water-bath method was higher than boiling method. Water-bath method combined with ethanol precipitation for extracted short DNA fragments had many advantages, such as economical and convenient which should be advocated to use widespread. Key words: nondenaturing polyacrylamide gel; short DNA fragments; recovery; purification
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
实用方法尤为重要。本试验在前人的研究基础上，对 比了两种从非变性 PAGE 胶中回收和纯化目标 DNA （51 bp）的简易方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试 验 材 料 pBluescript II SK(+ ) —PPRE vector， PPRE 是一段合成的长 51 bp 的 DNA 片段，其中 5'端含 KpnI 酶切位点，3'端含 XhoI 酶切位点。 1.1.2 试 剂 Fast Digest KpnI(Fermentas)；Fast Digest XhoI(Fermentas)；10×Fast Digest Buffer (Fermentas)；双 蒸水；丙烯酰胺；N,N'-亚甲基双丙烯酰胺；过硫酸铵； 10×TBE；1×TBE；TEMED；Loading Buffe（r 0.25%溴酚 蓝 ，0.25% 二 甲 苯 氰 ，40% 蔗 糖 水 溶 液）；20 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa)；无水乙醇：用前冰上预冷；乙 酸钠：3 mol/L，pH 5.2，用前冰上预冷。 1.2 试验方法 1.2.1 目的 DNA 的获取 pBluescript II SK(+)—PPRE vector 用 Fast Digest KpnI 和 Fast Digest XhoI 双酶切后 得到目的片段 PPRE（51 bp）。采用 20 μL Fermentas 酶 切反应体系，于 37℃水浴酶切反应 30 min，非变性聚丙 烯酰胺凝胶检测(如图 1)。 1.2.2 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 制 备 12% 非 变 性 PAGE 胶的制备参照文献[8]，但未加变性剂尿素。 1.2.3 PAGE 胶电泳 待 PAGE 胶聚合后，将玻璃板安装 在电泳仪上，于电泳槽中加入足量的 1×TBE 缓冲液， 拔 出 梳 子 。 电 泳 之 前 ，在 DNA 样 品 中 加 入 等 体 积 Loading Buffer 并 充 分 混 合 ，取 8 μL 上 样 。 以 20 bp DNA Ladder Marker 作 为 分 子 量 标 准 。 上 样 后 ，于 120 V 恒电压电泳至第二条 loading Buffer 带至胶板的 2/3 处。此过程在冰上进行，以获得较好的电泳效果。 1.2.4 溴化乙锭染色 将凝胶轻轻浸入 0.5 μg/mL 的溴 化 乙 锭 中 ，使 染 液 正 好 将 凝 胶 全 部 浸 没 。 室 温 染 色 30 min 后，将凝胶取出，紫外检测。 1.2.5 从 PAGE 胶中回收 DNA 片段 在凝胶尚未完全 干燥时用洁净的手术刀片切取欲回收的 DNA 条带（所 切 的 DNA 条 带 尽 可 能 少 带 凝 胶 ），放 入 1.5 mL Eppendorf 管内，加 100 μL 双蒸水洗涤，离心并吸弃双 蒸水，保留凝胶用于下一步的回收。以下是两种进一 步回收 DNA 的方法。
0 引言 随着生命科学的飞速发展，对生命奥秘的探索已
经深入到分子水平。从凝胶中回收 DNA 是分子生物 学实验中经常遇到的问题，特别是对 100 bp 以下的小 片段的电泳回收更是分子生物学的重要内容。小片段 DNA 的回收一般采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶
电泳(PAGE)[1]。研究表明，从聚丙烯酰胺凝胶中回收 的 DNA 纯度较高，可适用于分子生物学中较高要求的 实验[2-4]。虽然目前有几种常用的回收方法[5-7]，也有几 家知名生物试剂公司开发了相应的试剂盒，但这些回 收方法不是操作较繁琐就是回收成本较高。因此，探 索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的
中国农学通报 2011,27(7):227-230 Chinese Agricultural Science Bulletin
从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNA 小片段的 两种方法比较
章 蕾，袁 玲，黄建安，吴文亮，陈东生，刘仲华
（湖南农业大学茶学教育部重点实验室/国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙 410128）
从图 2 可看出，煮沸法和水浴法的回收产物经乙 醇沉淀纯化后，均获得了预期大小（51 bp 左右）的目的 片段（PPRE）。这进一步验证了煮沸法和水浴法回收 DNA 小片段的可行性；1 号和 2 号泳道中均没有出现 杂带，这说明经乙醇沉淀纯化处理的回收产物在纯度 上已经可以用于后续试验，进一步验证了用聚丙烯酰 胺凝胶回收的 DNA 的纯度较高；2 号泳道目的条带 （PPRE）的亮度明显高于 1 号泳道，这说明水浴法回收 DNA 小 片 段 的 回 收 率 高 于 煮 沸 法 ，可 以 广 泛 用 于 DNA 小片段的回收。
基金项目：国家自然科学基金“茶氨酸生物合成的基因转录调控研究”（3087157）；湖南农业大学人才稳定基金“茶树重要功能基因的克隆与鉴定” （07WD22）。 第一作者简介：章蕾，女，1986 年出生，湖南浏阳，硕士在读。通讯地址：410128 湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室，E-mail：zhanglei8665@163. com。 通讯作者：刘仲华，男，1965 年出生，湖南衡阳，教授，博士生导师，茶叶科学和药用植物资源功能成分研究。通信地址：410128 湖南长沙湖南农业大 学茶学重点实验室，E-mail：larkin-liu@163.com。 收稿日期：2011-01-05，修回日期：2011-03-17。