染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展1.

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００８年第４期收稿日期：２００７－０１－０７作者简介：闫素丽（１９８２－），女，汉族，在读硕士研究生，研究方向：作物遗传育种；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｓｕｌｉ２００５＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：安玉麟（１９５４－），男，研究员，硕士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｋｙａｎｙｕｌｉｎ＠１６３．ｃｏｍ染色体核型是指某一物种所特有的一组染色体或一套染色体的形态特征。

核型分析是对生物细胞核内全部染色体的形态特征进行分析，是物种分类的基本依据。

以核型为基础的染色体微分离、微克隆技术是指在显微镜下对特定染色体进行显微分离或显微切割，随后进行ＰＣＲ扩增、ＤＮＡ鉴定和克隆，进而可以快速的建立相应的ＤＮＡ文库、筛选有用探针、构建特定区域分子连锁图谱等。

目前该技术已经在动植物遗传与进化研究中显示出了独特作用。

对近年来核型分析和染色体显微切割技术的方法进行了综述，并简要介绍了其应用和前景。

１核型分析核型是根据细胞分裂中期浓缩的染色体形态结构建立的，核型模式图通常是将显微拍摄的染色体照片剪贴、整理、绘制而成。

不同的物种具有不同的核型，因此核型是区别物种的基本遗传学依据，也对分子生物学的研究具有指导意义。

１．１染色体标本的制作过程１．１．１取材核型分析多以初生根的根尖为材料，因为根尖易培养、不受季节影响，且细胞分裂旺盛、集中、容易辨别。

李懋学［１］认为凡能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞都可以作为取材的对象。

植物分生组织的生长具有一定周期性，这就限制了取材时间，一般认为取材应选在细胞分裂中期最为合适，研究表明，植物细胞分裂中期高峰一般出现在上午８：３０￣１１：３０，但也有植物分裂中期的时间段不只一个，如阿拉伯茶［２］１ｄ至少出现２个分裂高峰，因此，取材时要根据材料选择合适的时间。

１．１．２预处理核型分析的关键是预处理，合理的预处理能得到分裂相高，形态好的中期染色体。

实染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展闫素丽１，２安玉麟２孙瑞芬２李素萍２（１内蒙古农业大学，呼和浩特０１００１９；２内蒙古农牧业科学院，呼和浩特０１００３１）摘要：染色体核型分析是遗传学研究的重要手段，也是物种分类和鉴定的基本依据。

染色体显微切割技术是细胞遗传学和分子遗传学相结合的一种技术，应用前景广阔。

重点综述了染色体核型分析和单染色体显微切割技术的操作规程。

关键词：染色体核型分析显微切割微克隆ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＫａｒｙｏｔｙｐｅＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＭｉｃｒｏ－ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＹａｎＳｕｌｉ１，２ＡｎＹｕｌｉｎ２ＳｕｎＲｕｉｆｅｎ２ＬｉＳｕｐｉｎｇ２（１ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００１９；２ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｕｈｈｏｔ０１００３１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ，ｉｔｉｓａｌｓｏｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐｌａｎｔｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｒａｉｓａｌ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｃｒｏ－ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏ－ｃｌｏｎｅｉｓａｃｏｍｂｉｎｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅａｂｒｉｇｈｔｐｒｏｓｐｅｃｔ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｏｆｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍｉｃｒｏ－ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏ－ｃｌｏｎｅｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＫａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓＭｉｃｒｏ－ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎＭｉｃｒｏ－ｃｌｏｎｉｎｇ２００８年第４期际操作中常用的方法有物理方法和化学方法。

物理方法是用低温对材料进行处理，处理温度一般在０℃￣８℃，常用的方法是用冰水混合物４℃对材料进行处理，该方法的优点是简单、经济、安全。

化学方法预处理常用的试剂有：秋水仙素、对二氯苯、８－羟喹啉、α－溴荼和风油精等。

根据不同的材料选择合适的试剂，秋水仙素毒性较强，价格较高，处理效果好，但处理时间不能过长；对二氯苯预处理的效果与秋水仙素相当，也具有较强的毒性，价格较低；８－羟喹啉较适宜处理较大染色体的植物；α－溴荼对禾本科和水生植物的非离体材料处理效果较好［３］；风油精处理的特点是经济、安全，近年来在水稻［４］、烟草［５］、平邑甜茶［６］等植物上采用过，效果较好，但未见用于其它植物。

１．１．３固定固定是用渗透力强的固定液将材料迅速杀死，使细胞保持原有状态［３，７］。

常用的固定液有卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸＝３：１），也有少数人用甲醇冰醋酸溶液（甲醇：冰醋酸＝３：１）来固定材料。

１．１．４解离解离的目的是除去细胞壁与胞间层之间的果胶，软化细胞壁。

材料固定后应尽快解离。

研究表明，固定后立即解离的材料压片效果要优于固定后保存的材料［３］。

固定好的材料若不能及时解离应保存在７０％酒精中。

材料解离方法有酶解法和酸解法。

酶解法是用低浓度的果胶酶（１％￣２％）和纤维素酶（１％￣５％）的混合液解离材料，解离时间一般在室温下２￣５ｈ。

酸解法一般是将材料放入预热６０℃的１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ中解离，解离时间视不同的材料而定，一般为几分钟到十几分钟或更长［８］。

１．１．５染色为方便观察分析要对染色体染色，常用的染色剂有醋酸洋红、铁矾－苏木精、Ｓｃｈｉｆｆ试剂、品红、改良的卡宝品红等。

染色时根据不同的材料选择合适的染色剂，但染色时要保证细胞质不染色或染色浅，以免影响观察效果。

１．１．６制片常用的制片方法有压片和涂片２种，常规压片法不固定，只要压片时盖玻片保持不动使染色体分散开来即可，此方法容易操作；涂片法要先将材料弄碎，使细胞均匀分散开，再制片观察，这种方法操作较复杂，但能使细胞更好的分散开。

１．１．７检片、封片在低倍镜下找到分散良好的中期相细胞后，调到高倍镜下观察拍照。

若不能及时对片子进行拍照或想短时间保存较好的片子，可以用石蜡、凡士林、甘油（稀释后加一滴甲醛）或无色指甲油把盖玻片的四周密封起来，置于冰箱冷藏室保存［８］。

１．２核型分析方法１．２．１手工核型分析法核型分析时通常按照李懋学［９］的标准来确定染色的数目、形态；按Ｓｔｅｂｂｉｎｓ［１０］的方法确定核型类别。

其过程是选取数目完整，分散良好的染色体标本进行显微照相，照片放大后将染色体逐条剪下，以染色体长度和着丝点２个参数为依据对染色体进行人工配对，测量出长臂与短臂，并算出它们的平均值、相对长度及臂比，绘制出核型模式图。

由于这种方法是手工进行的，费时、费力、测量误差也比较大。

因此，一定程度上影响了核型分析的准确性。

１．２．２染色体图像核型分析系统分析法染色体图像核型分析系统是一以电脑和手工核型分析步骤为基础的染色体核型分析系统，能够准确、快速、方便的将原始染色体显微图像转变为整齐的染色体分类图像，并能将结果分析、输出及储存［１１￣１３］。

因此，可以将研究人员从枯燥的手工测量中解放出来，提高工作效率，但其缺点是耗资较大。

１．２．３利用ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ软件进行核型分析电脑系统运用ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ软件，不仅能够很容易地完成染色体的配对排列，非常精确地测量染色体各臂的长度及全长，建立核型模式图，而且可以去除原照片中的斑点、划痕、调整亮度对比度、对交叉重叠的染色体臂进行修整等，使分析结果比较完美。

因此当此软件推出时，国内外许多人就尝试运用它在教学、科研及临床实践中进行核型分析［１４］。

另外ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ可以以ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ软件测量的染色体长度数据为基础，绘制出精确的核型模式图［１５］。

ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ软件与ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ软件的结合使用将会使核型分析结果更加完美，这与染色体核型分析系统相比较费用大大降低，而且操作方便。

目前，已经广泛应用在核型闫素丽等：染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展７１生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第４期分析研究中。

２染色体微切割、微克隆技术染色体微切割、微克隆技术最早是１９８１年Ｓｃａｌｅｎｇｈｅ等［１６］创立的，它为遗传学研究提供了有力的手段，但当时滞后的扩增技术限制了该技术的发展。

随着１９８９年ＰＣＲ技术与微分离、微克隆技术的结合，该技术进入了一个新阶段并广泛应用于基因工程研究。

其技术流程为染色体标本的制备、目标染色体的识别、微分离、分离片断的ＰＣＲ扩增和鉴定等。

２．１染色体标本的制备及目标染色体的识别用于显微分离的染色体标本制备方法与常规制片基本相同，只是固定液中酸的比率要适当降低，以减少酸对ＤＮＡ的破坏，宋文芹［１７］在制片中用７０％酒精取代了传统的固定液。

为使细胞质背景清楚，崔丽华等［１８］采用去壁低渗法，提高了染色体分离的效率。

但无论用什么方法，都要使染色体尽量散开，易于识别目标染色体。

目标染色体的识别，早期报道主要是一些染色体容易识别的材料，如田靫等［１９］对附加在ＴＡＩ－２７中的中间偃麦草染色体进行了分离；何聪芬等［２０］成功的分离了携带抗病基因的单价体。

这种方法的优点是所分离的染色体不受伤害，能够建立完整的ＤＮＡ文库，但其缺点是只能识别一些容易辨认的染色体，对于复杂、难分辨的染色体很难操作。

分带技术的出现及应用使得任意一条染色体或者染色体任意区段的显微切割成为可能。

田靫［２１］将Ｃ－分带技术运用在小麦１Ｄ染色体的微切割上，并进行了微克隆。

２．２目标染色体的显微切割和分离目前染色体显微分离与切割的方法主要有４种，即微细玻璃针法、激光显微切割法、流式细胞仪法、微细玻璃针切割法和显微激光切割相结合的方法。

２．２．１微细玻璃针法微细玻璃针法是借助倒置显微镜用尖端直径不超过０．５μｍ的细玻璃针对目标染色体进行直接切割，将切割下来的染色体连同细玻璃针的针尖一同折断于放有蛋白酶Ｋ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，高速离心数秒后，将得到的染色体ＤＮＡ用于ＰＣＲ扩增或者－２０℃保存备用。

这种方法是染色体显微切割的基本方法，其特点是技术要求较高、不容易掌握，但是其较低的费用使得这项技术已经在玉米［２２］、花椰菜［２３］、石蒜［２４］和木本植物银杏［２５］、欧洲山杨［２６］、柚［２７］等多种植物中广泛应用。

２．２．２激光显微切割法激光微束是２０世纪６０年代激光技术问世后在生物学和医学领域中出现的一项新技术。