高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究

高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究

引言

石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。

1 实验材料和方法

1.1 菌株来源

采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口

处污泥进行菌株筛选。

1.2 培养基

基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。

以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。

富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。

1.3 研究内容与方法

1.3.1 菌株和的驯化和分离

在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。取1mL菌原液加入无菌水中分别制成100、10- 1、10- 2、10- 3、10-4等梯度的菌液，然后分别从各菌液试管中取1mL用涂布法接种于基础培养基平板上。在pH 值为7、25℃情况下培养24～48h。挑取单一菌落于富集培养基平板上划线、扩繁。编号，将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24～48h后放于4℃冰箱保存。依据革兰氏染色进行微生物鉴定。

1.3.2 降酚菌的筛选

将OD（吸光度）为600的单一菌株，按20%（体积分数）的接种量接入无机盐培养基中，筛选同一时间内对苯酚降解能力最强的作为优势菌株。

1.3.3 培养温度对菌株降酚能力的影响

在pH值为7时，蘸取适量的菌液涂布培养与生化培养箱中调节温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。24h后测定苯酚浓度计算苯酚降解率。

1.3.4 培养pH值对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量接种于苯酚浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，培养条件为28℃、270 r/min，调节pH值为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，研究pH值对菌株降酚能力的影响。24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.3.5 底物浓度对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量分别接种于苯酚浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.2g/L的富集培养基中，培养条件为270 r/min、28℃、pH值7，比较菌株在苯酚浓度不同时对苯酚降解率的影响，24 h 后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率[9]。

1.3.6 接种量对菌株降酚能力的影响

设置菌株接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%，菌株培养条件为pH值为7、270r/min、28℃、底物浓度为1000mg/L、装液量50mL，24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.4 分析测定方法

分析温度、接种量、pH值及底物浓度等因素对该苯酚降解菌降解性能的影响。采用4-氨基安替吡林分光光度法测量苯酚浓度。苯酚的降解率由式（ 1）计算[10]。

降解率（ %） = （1-处理后体系中苯酚浓度/体系中苯酚浓度）×100% （1）

2 结果与讨论

2.1 降解菌的初步鉴定

对得到苯酚降解菌株进行初步鉴定，并分别命名为BF-1、BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6，其中BF-2菌株生长速度最快在培养基上直径达到89.1mm（平板直径90mm），BF-4菌株生长速度最慢在培养基上直径为56.4mm。镜检为革兰氏阴性菌，单个细胞呈杆状，细胞单个或数个连接。（见表1）。 2.2 温度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同温度下苯酚降解菌的降解率见图1。比较不同温度下菌株的降解率，可以发现菌株在温度在25～40℃时，随着温度的升高，苯酚降解率逐渐降低。在25℃时6株菌株的苯酚降解效果均达到最佳。

其中，BF-2的苯酚降解率最高，达到89.7%，BF-4的苯酚降解率最低，为65.5%。在培养温度为30～40℃时，菌株的降解能力逐渐减弱，40℃时BF-2的降解率降为57.6%，此时BF-1的苯酚降解率最低，为49.1。根据数据分析得出：菌株最佳苯酚降解温度为25℃。

2.3 pH值对苯酚降解菌降解性能的影响

不同pH值下苯酚降解菌的降解率见图2，培养48h，仅BF-6在pH值为8.0时苯酚降解效率达到最高，为71.4%，其余菌株均在pH值为7.0时对苯酚的降解率达到最大，此时，BF-2的降解效果最好，苯酚降解率达78.0%；BF-4的降解效果最差，苯酚降解率为58.0%。在pH值为5.0和9.0时由于酸性和碱性过强导致酶蛋白变性从而失活，使细菌生长迟缓，降酚能力减弱。由此可见中性或弱碱性环境更有利于苯酚降解菌对苯酚的降解。根据实验数据分析得出：苯酚降解菌最适降解pH值为7.0或偏碱性。

2.4 底物浓度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同底物浓度在降解24h后苯酚降解菌的降解率见图3，在苯酚浓度为100～2200mg/L时，BF-2的降解效果是6株菌株中最好的。BF-2在苯酚浓度为100mg/L时苯酚降解率高达93.3%；此时，BF-4的苯酚降解率最低，为67.5%。在苯酚浓度为2200mg/L 时，BF-2对苯酚的降解率降至39.6%；此时，BF-4的降解率仅为15.2%。根据实验数据分析得出：随着苯酚浓度的升高，苯酚降解率逐渐降低。

2.5 接种量对苯酚降解菌降解性能的影响

接种量对苯酚降解率的影响见图4。接种量在5%～20%时，菌株对苯酚的降解能力随接种量的增加而逐渐增大。在接种量等于20%时，6株菌株对苯酚的降解率均在此时达到最大。其中，