分子生物学实验技术 郭秋平
荧光PCR知识
摘要：在进行基因分离、克隆和核苷酸序列分析等生物过程中，通常会运用到聚合酶链反应技术，即PCR技术。
荧光PCR是近年来科学家和学者常用的手段，本文就对荧光PCR的原理、常用探针的优缺点以及多重荧光PCR技术的进展进行了综述。
关键词：荧光PCR；探针；多重荧光PCR聚合酶链反应( PCR) 技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用[1]。
但是，利用传统的PCR 技术进行检测鉴定时，需要进行扩增反应后的电泳分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制[2]。
荧光PCR 技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具[1]。
1、荧光PCR原理荧光PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。
荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。
Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
Ct值是实时荧光PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。
每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。
因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
与普通PCR相比，荧光PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。
概括地说，荧光PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量[2]。
2024年《分子生物学实验》课程教学大纲
《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学技术在新型脱氮工艺微生物学研究中的应用与进展.
分子生物学技术在新型脱氮工艺微生物学研究中的应用与进展
全部作者：
郭劲松秦宇方芳杨国红
第1作者单位：
重庆大学3峡库区生态环境教育部重点实验室
论文摘要：
分子生物学技术作为1门现代生物学，弥补了常规微生物学试验的不足，能对环境样品中的微生物进行原位观察，有效、快速、准确地反映环境样品中的微生物信息。
回顾分子生物学技术在SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等新型脱氮工艺中微生物学研究方面的应用与进展，该技术为其机理探讨提供了可靠的科学依据，作出了重大贡献。
同时介绍了应用于环境领域中最常用的几种分子生物学技术，并对其在该领域的发展进行了展望。
关键词：
分子生物学，微生物，新型脱氮工艺 (浏览全文)
发表日期：
2006年10月09日
同行评议：
（暂时没有）
综合评价：
（暂时没有）
修改稿：。
分子生物学实验(任峰)2011
实验二 PCR克隆目的基因
一 实验原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外 扩增DNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(56℃左右)下与模板上 的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的 DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩 增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经 25-35 轮循环就可使DNA 扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。
4 种 dNTP
浓度适当，避免反复冻融 • dNTP 原液配成10mM或者2.5mM分装,20oC贮存。 • 一般反应中每种dNTP 的终浓度为20200μM。当dNTP 终浓度大于50mM 时可 抑制Taq DNA 聚合酶的活性. • 4 种dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中 由于某种dNTP 的不足出现的错误掺入。
2. 引物
• PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决 定。引物的好坏往往是PCR 成败的关键 • 引物影响因素： 特异性： 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性： 避免反复冻融 浓 度： 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 扩增产物太少
引物设计原则
(1) 引物长度： 约为16-30b (2) G+C含量： G+C含量通常为40%-60%, 较短引物 可粗略估计Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基随机分布，在3‘端不存在连续3 个G 或 C,因这样易导致错误引发。 (4) 在引物内及两引物之间, 尤其在3‘端应不存在二 级结构。 (5) 引物5‘端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计 时加上限制酶位点。 (6)引物不与模板结合位点以外的序列互补
医学分子生物学实验技术
医学分子生物学实验技术课程教学大纲
课程负责人：苑辉卿张利宁
课程名称：医学分子生物学实验技术（Experimental Protocols in Medical Molecular Biology）
开课学期：
课程学时：72学时（3学分）
课程教学目标：通过对现代分子生物学实验基本原理和技术的学习，从医学生物学角度培养研究生从事科学研究的能力。
课程内容：
基因克隆：构建一个载体
基因表达：mRNA水平
蛋白质水平
真核基因组分析技术
教学要求：
通过实验原理的讲解、实验示教和实验操作，掌握现代分子生物学实验的基本原理、操作技能和实际应用。
考核方式：实验设计
参考书目：
1. 孙汶生等编.《基因工程学》
2. 金冬雁等译.《分子克隆实验指南》.科学出版社
3. 吴乃虎编.《基因工程原理》
4. 子颖等译.《精编分子生物学实验指南》.科学出版社
5. 卢圣栋等编译.《现代分子生物学实验指南》。
分子生物学实验技能
PCR反应体系与反应条件
dH2O 10ΧPCR反应缓冲液 25 mM Mg2+ 6.1 μ L 1 μL 0.8 μ L
95℃ 2’30’’
DNA 双螺旋结构
1953年沃森和克里克提出 了DNA的双螺旋结构,开创 了分子生物学的新纪元。
并在此基础上提出的中心
法则，描述了遗传信息从 基因到蛋白质结构的流动
常见的DNA符号
gDNA（基因组DNA） plasmid DNA（质粒DNA） mtDNA（线粒体DNA） ssDNA(鲑鱼精DNA) cDNA(互补DNA)
问题可能原因解决方法产量太低样本裂解或匀浆不充分延长匀浆时间rna沉淀溶解不充分65加热可促进溶解a260a280165匀浆时样本太多而抽提液使用量太小增加rna抽提试剂用量匀浆后样本没有静置室温静置5分钟促进裂解反应水相中可能有酚残留吸取上清时应注意操作的正确性rna沉淀溶解不充分加热可促进溶解测比值时rna溶解在depc水中低的离子浓度和ph值增加了280nm的吸光值比值时采用te溶液溶解rnarna降解取样操作不正确取样后应立即抽提和冻存样本保存不当80或液氮保存液相中可能有rna酶污染采用rna抑制剂制胶时所用甲醛的ph值小于35试剂新鲜配制dna污染匀浆时样本太多而抽提液使用量太小增加抽提液用量蛋白多糖污染抽提时蛋白和多糖去除不彻底rna沉淀时加入部分盐溶液选择性沉淀rna原位杂交insituhybridization原位核酸分子杂交技术insitunucleicacidmolecularhybridization简称原位杂交技术
分子生物学-第一章-第五节
分子克隆技术
1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入 大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA 分子体外重组和扩增的全过程，这是基因工程发展史上 第一个克隆转化并取得成功的例子。
5
基因工程技术
基因工程技术经历了安全问题的争论和改造载体阶段， 当前已将突破点集中于外源基因在宿主细胞内的表达问 题上，确切地说，更集中于真核基因在原核细胞表达的 基因工程技术。
10
PCR技术
PCR技术传统的应用领域：医学、农业、生物工程学。 随着PCR诞生而直接出现的新兴学科中的三个：生物分子 考古学，分子生态学以及DNA法医学。
11
8
PCR技术
Kary Mullis 1990年在《科学美国人》上的一篇文章，及1998 年的自传《心灵裸舞》(Dancing Naked in the Mind Field) ， 都曾提到PCR这个构想的起源。
PCR技术
1985年某一天晚上，Kary Mullis在驾车沿着California海岸 线兜风时，灵机一动，发明了聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）。这一灵感所带来的 结果就是：这项非常简单的技术，作为基因克隆的完美补 充，在分子生物学的发展上发挥了关键的作用，引起了分 子生物学研究的一场革命。
第一章 前 言
1
第一章 前 言
第五节 现代分子生物学技术
2
生命科学实验技术概况
生命科学是实验的科学，分子生物学的飞速发展不仅 渗透和影响着生命科学的各个分支，也全面推动着生 命科学实验技术的纵深发展。
3
第一个体外重组的人工DNA分子
1972年，美国斯坦福大学（Stanford University）的Berg等首 次用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ切割猴子身上的病毒SV40 DNA 和噬菌体λDNA，又将两者连接在一起，成功地构建了第一个 体外重组的人工DNA分子。
基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测
基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测郭秋平;赵下雨;谢琴;王柯敏;万俊;袁宝银;谭誉宇【摘要】A novel label-free fluorescence signal amplifying method for DNA detection was developed with high specificity and sensitivity based on a long arm hairpin nucleic acid probe and exonuclease Ⅲ( Exo Ⅲ) . Without the target DNA, the SYBR Green Ⅰ dye could be embedded into the stem of hairpin nucleic acid probe to generate strong fluorescence. While in the presence of target DNA, Exo Ⅲ could catalyze the step-wise removal of mononucleotides from 3’-OH termini of double-stranded DNA with the degradation of the hair-pin probe. After that, the target DNA was released, triggering the next cycle of exonuclease digestion reac-tion. Then the SYBR Green Ⅰ was continuously released, resulting in fluorescence intensity decreased. It rea-lized the label-free signal amplifying detection of DNA. The detection limit of this method was as low as 320 fmol/L. It can be expected to provide a novel, simple, label-free and rapid tool for DNA detection.%设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法。
结核病分子生物学检测技术研究进展
基于上述研究 在检测涂片阳性肺结核 显示 和 B-J*++/
'PE1E`;EDC
BOPPPS教学模式在分子生物学教学中的探索与实践
BOPPPS教学模式在分子生物学教学中的探索与实践目录一、内容描述 (2)1.1 研究背景 (3)1.2 研究意义 (5)1.3 文献综述 (6)二、BOPPPS教学模式概述 (7)2.1 BOPPPS教学模式的定义 (8)2.2 BOPPPS教学模式的核心要素 (9)2.3 BOPPPS教学模式的特点 (10)三、BOPPPS教学模式在分子生物学教学中的理论基础 (11)3.1 基于建构主义的学习理论 (13)3.2 基于认知主义的学习理论 (14)3.3 基于掌握学习的学习理论 (15)3.4 基于人本主义的学习理论 (17)四、BOPPPS教学模式在分子生物学教学中的探索与实践 (19)4.1 教学设计 (20)4.1.1 明确教学目标 (21)4.1.2 设计教学策略 (22)4.1.3 选择教学资源 (24)4.1.4 评估教学效果 (25)4.2 教学实施 (27)4.2.1 情境创设 (28)4.2.2 问题引导 (29)4.2.3 小组讨论 (30)4.2.4 实验操作 (31)4.2.5 反思评价 (32)4.3 教学效果评估 (33)4.3.1 学生学习成果评价 (35)4.3.2 教师教学效果评价 (36)4.3.3 课程体系评价 (38)五、结论与展望 (39)5.1 研究结论 (40)5.2 研究不足 (41)5.3 研究展望 (42)一、内容描述BOPPPS教学模式是一种以学生学习为中心的教学方法，广泛应用于各种学科的教学过程。
分子生物学作为生命科学的核心学科，其教学要求高，知识点复杂，对学生的学习能力和理解能力要求严格。
将BOPPPS教学模式引入分子生物学教学中，有助于提升教学质量，促进学生深度学习和全面发展。
本文档主要探讨并实践了BOPPPS教学模式在分子生物学教学中的应用。
分子生物学是生命科学领域的重要分支，涉及生命现象分子层面的研究。
随着科技的进步，分子生物学的研究内容和技术手段日新月异，使得分子生物学的教学面临着巨大的挑战。
现代分子生物学实验原理与技术
2.实验方案 1 基因操作实验的主要目的有三个：
①分离目的基因,获取DNA信息； ②分析基因结构； ③分析基因功能,
2 试验流程设计 首先,应确定使用怎样的研究方案； 其次,根据试验规模和研究室情况； 最后,根据研究人员生活规律确定试验时间,
3.实验方法 在设计实验方法时应考虑 ①能否达到实验目的； ②是否符合实验室现状； ③是否符合自己的喜好,
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
②加双蒸水至800ml,混合均匀,
③高温高压灭菌,室温保存,
2 制作平板
材料：煤气灯或酒精灯
水平台面
1L三角瓶
铝箔纸
直径9cm的培养基
药匙
试剂
琼脂粉
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
琼脂粉
②铝箔纸封口,混匀,灭菌, ③待冷却至60℃左右,分装至培养皿, ④水平台上凝固, ⑤倒置塑料袋中4℃保存,
烧,将初始培养菌转入大量培养基中,盖上 盖子,再灼烧瓶口,
④37℃震荡过夜, 3 菌落测定
平台期
对数生长期
诱0时
为指数生长期,A 6＞00 1.0 为平台期,A =1.6000为10 个/ml8,
①在煤气灯旁用微量移液器吸 培养液,转至Eppendrof管, ②打开分光光度计,调整波长 至600nm,
注意： 1、若需要加入抗生素,待冷却至60℃ ,分装前加 入, 2、直径9cm的平皿,每皿25ml为宜, 3、尽量缩短平皿开盖时间,分装的培养基很快凝 固,因此操作要快, 4、凝结在盖上的水珠可能至污染,故倒转存放, 5、氨苄青霉素易失活,添加后的平皿应在数 （ZHOU）内使用,
分子生物学实验 学习指南
学习指南分子生物学实验课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。
该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。
要求学生掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理和基本实验操作技术，进一步培养学生的实践能力、独立分析问题、解决问题、动手操作的能力。
该课程126学时，3学分。
教材：魏群主编，《分子生物学实验指导》（第二版），高等教育出版社，2007年。
主要参考书：魏群等译，基因克隆和DNA分析，第五版，高等教育出版社，2007。
吴乃虎编著，《基因工程原理》，第二版，科学出版社，2001年。
黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002年。
梁国栋主编，《最新分子生物学实验技术》，科学出版社，2001年。
Molecular biology （5th edition，by Robert F. Weaver）Molecular cloning： a laboratory manual （4th edition, by Michael R. Green and Joseph Sambrook)教学资源：北京师范大学分子生物学实验精品课程教学网络平台。
教学策略与方法建议：本课程采用传统的实验教学方法，结合多媒体、讲座、小组讨论与集体讨论、实验设计、网络教学、教学录像、分子生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，以提高学生从事科学研究的综合素质和实践能力。
要求学生先学习普通化学及实验；有机化学及实验、微生物学等课程。
上课期间注意听讲，做好记录，多动手，善于观察，与组员协作好，合理安排时间。
分子生物学检验技术第1章
贰
二、基因变异与单基因病
多基因病的发病机制十分复杂，遗传因素和环境因素共同起作用。
01
这些病的发病有一定遗传基础，常表现出家族倾向，但却又不符合一般的遗传方式。
02
三、基因变异与多基因病
02
多基因病的发生涉及诸多因素，某一因素的变异不足以解释多基因病的发病机制。
01
参与多基因病发生的基因被称为疾病相关基因。
01
生物芯片必将在基因功能研究、基因诊断、药物筛选和个体化药物治疗等方面扮演重要角色，具有重大的应用潜力。
02
二、生物芯片
三、蛋白质组学
当今的研究重点已经开始从揭示生命的遗传信息过渡到对生命活动的直接执行者——蛋白质进行整体水平的研究，蛋白质组学正成为目前揭示生命规律的新的重大热点领域。
三、基因变异与多基因病
线粒体DNA突变使线粒体功能发生障碍，直接影响人体组织和细胞的各种生物学功能，导致线粒体 遗传病。
01
它具有母系遗传、基因突变具阈值效应以及多系统受累等遗传学特征。
02
四、线粒体基因变异与线粒体遗传病
肿瘤的发生是由多种致癌因素综合作用的结果。
癌基因包括病毒癌基因和细胞癌基因,它们具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。
编者（以姓氏笔画为序）
卫生部“十一五”规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材
唐冬生（佛山科学技术学院） 钱 晖（江苏大学） 倪培华（上海交通大学） 黄迪南（广东医学院） 彭 颖（温州医学院） 樊绮诗（上海交通大学）
01
编者（以姓氏笔画为序）
02
卫生部“十一五”规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材
01
02
03
04
05
分子生物学实验教学改革初探
分子生物学实验教学改革初探盖颖;史玲玲;侯佳音;汪晓峰【摘要】The aim of molecular biology experiments is to train students to research ability, combined with the frontier to help students understand the basic skills. This article explored the teaching reform of molecular biology experiment by rearranging teaching contents, teaching and evaluation methods to improve the students’ learning interest and ability, and achieved good teaching effect.%分子生物学实验是为了配合分子生物学理论课教学、培养学生的实践动手能力和科研能力，并结合学科前沿帮助学生了解实验的基本过程与掌握实验的基本技能。
通过重新安排教学内容、丰富教学手段、完善考核方式三方面的教学改革，有效提高学生的学习兴趣和能力，取得了良好的教学效果。
【期刊名称】《中国现代教育装备》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】2页(P46-47)【关键词】分子生物学实验;内容重排;教学方式【作者】盖颖;史玲玲;侯佳音;汪晓峰【作者单位】北京林业大学生物科学与技术学院北京 100083;北京林业大学生物科学与技术学院北京 100083;北京林业大学生物科学与技术学院北京 100083;北京林业大学生物科学与技术学院北京 100083【正文语种】中文分子生物学实验教学是学生理解和掌握分子生物学基本原理的必需环节。
分子生物学技术具有发展快、种类多的特点，本科学生不可能实际操作所有实验。
分子生物学实验手册handbook
分子生物学技术实验手册高雄医学院生物学系游仲逸、张永福编着目录实验一：Genomic DNA的制备实验二：Total RNA的制备实验三：聚合脢连锁反应实验四：DNA选殖实验五：基因转型实验六：质体DNA的少量制备和限制脢切割分析实验七：DNA定序分析实验八：北方点墨分析实验九：在大肠杆菌内大量表现重组蛋白实验一：Genomic DNA的制备实验目的纯化genomic DNA是一系列DNA分析，如南方点墨法(Southern blotting)，聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)，基因组库(genomic library)之建构及筛选等的前置步骤。
本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取genomic DNA。
你将从本实验中学习如何自细胞或组织中萃取并纯化genomic DNA。
实验原理本实验是以动物组织或细胞作为genomic DNA的来源。
先以阴离子性清洁剂如sodium dodecyl sulfate (SDS)将细胞打破，并使蛋白质变性，以抑制DNase的活性，也让DNA上的蛋白质解离。
同时加入高浓度的ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)亦可抑制DNase的活性。
另外以RNase除去RNA。
而蛋白质则不以有机溶剂如phenol来萃取掉，而是以盐类沉淀方法去除。
如此可避免使用具毒性之有机溶剂，而DNA亦较不会断裂。
萃取到的genomic DNA以酒精沉淀法浓缩，并回溶于TE缓冲溶液中保留。
最后，测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度。
纯DNA的A260/A280比值约为1.8，比值太低时，表示蛋白质残留太多。
DNA浓度计算方式为OD260=1时，DNA浓度约为50 g/ml。
实验材料∙RBC lysis solution：ammonium chloride, EDTA, sodium bicarbonate∙Cell lysis solution：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 0.5% SDS∙RNase A solution：4 mg/ml RNase A∙Protein precipitation solution：10 M ammonium acetate∙Isopropanol∙70% ethanol∙TE缓冲溶液：10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA实验步骤1. 首先要将细胞溶解，不同材料之处理方式略有差别。
安建平、王廷璞合著的《生物化学与分子生物学实验技术教程》一书出版
作者： 维洞
出版物刊名： 天水师范学院学报
页码： 38-38页
主题词： 分子生物学;实验技术;生物化学;出版社;教程;聚合酶链式反应技术;DNA重组技术;
分离纯化技术;分子杂交技术
摘要：由我校生命科学与化学学院教师安建平、王廷璞合著的《生物化学与分子生物学实验技术教程》一书，已由兰州大学出版社正式出版。
该书分为三篇，第一篇为生物化学和分子生物学实验技术基本理论，包括生物大分子制备技术、分光光度技术、电泳技术、离心技术、层析技术、核酸的分离纯化技术、DNA重组技术、分子杂交技术、聚合酶链式反应技术、DNA序列测定技术、生物芯片技术等十一章。
分子生物学实验技术-郭秋平ppt课件
完整最新ppt
6
DNA 序列 完整最新ppt
7
DNA分子一级结构中的显著特点，
顾名思义，就是脱氧核糖了。也
就是核糖的２’位上没有自由羟
基．这也就是DNA这一主要遗传
物质极其稳定的根本原因。特别
是对于碱的抵抗力，在pH１１．5
时，DNA链的一级结构几乎没有
任何变化，而RNA链在几分钟内
降解为2’单磷酸核苷和3’单磷酸核
杂交示意图
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四：Cot 曲线
在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓 度,t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA 顺序复杂性的 关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强 度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定,以不同程度的核酸 分子重缔合部分(在时间t时的复性率)取对数后对Cot作图,可以得到 如图所示的曲线,用非重复碱基对数表示核酸分子的复杂性。在 DNA总浓度(以核苷酸为单位)相同的情况下，片断越短，片断浓度 就越高，复性所需的时间也越短t1/2也越小 。
（4）大沟和小沟 沿螺旋铀 方向观察，两条主链和碱基 并不充满双螺旋的空间，双 螺旋的表面形成两条凹槽， 一条宽而深，叫做大沟，一 完整最新p条pt 狭而浅，叫做小沟。 10
碱基位于双螺旋的内侧，
磷酸和核糖在外侧，
通过3’，5’－磷酸二酯键构 成骨架。
碱基平面与纵轴垂直，
糖环平面与纵轴平行。
大沟：宽1.2nm，深 0.85nm，小沟：宽0.6nm， 深0.75nm。
当由于温度等因素使碱基分子内能增加时．碱基的定向排 列遭受破坏，从而削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力， 会使DNA双螺旋结构受到破坏。（如加热、高温）
分子生物学实验教学内容及技术研究
分子生物学实验教学内容及技术研究
陈佩林
【期刊名称】《畜牧与饲料科学》
【年(卷),期】2011(000)002
【摘要】根据深化教育体制改革、全面推进素质教育的指导思想,分析了传统分子生物学实验教学中存在的问题.通过调整教学计划,改革课程体系、教学内容和教学手段,强化基本操作训练以及严格进行实验考核等方法,提高了实验教学质量,增强了学生分析问题和解决问题的能力.
【总页数】2页(P38-39)
【作者】陈佩林
【作者单位】南通大学生命科学学院,江苏南通,226009
【正文语种】中文
【中图分类】G642.0
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DNA 序列
DNA分子一级结构中的显著特点， 顾名思义，就是脱氧核糖了。也 就是核糖的２’位上没有自由羟 基．这也就是DNA这一主要遗传 物质极其稳定的根本原因。特别 是对于碱的抵抗力，在pH１１．5 时，DNA链的一级结构几乎没有 任何变化，而RNA链在几分钟内 降解为2’单磷酸核苷和3’单磷酸核 苷。RNA碱水解先生成一个2'，3' 环式单核苷酸中间产物，由于是 一个五员环，稳定性较差，很快 转变成2'单核苷酸和3'单核苷酸.
分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实 验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源 不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子 (heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与 DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现 复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成为单链,因此,变性技术也是核酸 杂交的一个环节。
4．碱基分子内能
当由于温度等因素使碱基分子内能增加时．碱基的定向排 列遭受破坏，从而削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力， 会使DNA双螺旋结构受到破坏。（如加热、高温）
三：DNA的变性
概念：指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线 性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键 和疏水键的断裂。 特点：
光吸收法．流体力学法，量热法，极谱法，
完全变性DNA即单链DNA的A260＝1.37．
单核苷酸的等比例混合物的A260＝1.60。 由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为 增色效应（hyperchromicity）。 当缓慢而均 匀地(目前可以做到 0.1℃／分)增加DNA溶液 的温度，记录各个不同温度下的数值，即可 绘制成DNA的溶解曲线，如左图所示。当 A260增加到最大增值的一半时，即相当值 A260达到约1．185时，这时的温度叫做DNA 的熔解温度或熔点，用Tm表示。这是一个 鉴定DNA的非常有用和非常方便的参量。
蛋白质存在于所有 的生物细胞中，是 构成生物体最基本 的结构物质和功能 物质。 蛋白质是生命活动 的物质基础，它参 与了几乎所有的生 命活动过程。
1 蛋白质的结构组成
蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、 氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有 其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和 铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： • 碳 50％ • 氢 7％ • 氧 23％ • 氮 16% • 硫 0—3％ • 其他 微 量
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列,这需要牵涉到另 一项核酸操作的基本技术─探针(probe)的制备。探针是指带有某些 标记物(如放射性同位素32P,荧光物质异硫氰酸荧光素等)的特异性 核酸序列片段。若我们设法使一个核酸序列带上32P,那么它与靶序 列互补形成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交 链的放射信号,即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。 在现代分子生物学实验中,探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成 的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结构与 功能研究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因 诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领 域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。
• DNA与RNA结构相似，组成成份上略有不同
核酸的组成
核酸 核苷酸
水 解
核苷
磷酸
戊糖
碱基
核
酸
核苷酸
代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖， 对RNA而言为核糖； 代表碱基 代表磷酸基
DNA的一级结构
DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排 列顺序 ,DNA从结构上来说是由脱氧核糖核苷 单磷酸通过3'，5磷酸二酯键连接而成的高聚 物。从同一个磷酸基的3’酯键到5’酯键的方向 定为链的方向。在大多数天然DNA分子长链 的两端，总是有一个核糖带有自由的5’磷酸， 而另一端的核糖带有自由的3'羟基，前者称为 5'端，后者称为3’端。DNA链的方向就是从5' 端到3'端。
3.茚三酮反应：可作为氨基酸定量分析方法。
• 构成蛋白质的20种氨基 酸在可见光区都没有光 吸收，但在远紫外区 (<220nm)均有光吸收。 • 在近紫外区(220-300nm) 只有酪氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸有吸收光的能 力。 • 酪氨酸的max＝275nm， 275=1.4x103; • 苯丙氨酸的max＝ 257nm，257=2.0x102; • 色氨酸的max＝280nm， 280=5.6x103;
分子生物学实验技术
郭秋平
核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖 核酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。 • 核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸
四：离子强度
已经变性的DNA需要下列条件才能复性： (1)有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用 的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCI； (2)有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不 能太高．否则配对碱基之间的氢键又难以形成的。一 般使用比Tm低20℃-25℃的温度 。
三：杂交
氨基酸的 光吸收
氨基酸的离解性质
• 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧 基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离 子中，氨基是以质子化 (-NH3+) 形式存在，羧基是以离 解状态(-COO-)存在。 • 在不同的 pH 条件下，两性离子的状态也随之发生变化。
COOH H3N
+
C H R
•
碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当 于摩尔核苷酸
30.98 A P）＝ （ WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
测量变性的方法：
旋光色散法，圆二色性法，层析法等。 光吸收法：DNA中的碱基的嘌呤环和嘧啶环 中的转变，在260nm有明显的吸收峰。当 DNA变性时，有序的碱基排列被打乱了，于 是增加了对光的吸收。 如当浓度都为50ug／ml时， 双螺旋DNA的 A260=1.00，
1.
2. 3.
断裂可以是部分的或全部的，
是可逆的或是非可逆的。 不涉及到其一级结构的改变。
变性能导致DNA以下一些理化及生物学性质的改变。
溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的"刚性"结构,变性后代之 以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而 明显下降。 溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子 局部的构性改变, 使DNA溶液的旋光性发生变化。
增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250－ 280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子 中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋 结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。
变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外 吸收,故而产生增色效应。
二、决定双螺旋结构状态的因素
1．氢键： 在每一个碱基上都有适于形成氢键的供氢体如氨基和羟基以及受氢 体如酮基和亚氨基。 （Tm为溶解温度）
Ｔm＝69.3十0.41(％G十C) （Marm点：特异性很强 高度的方向性
2．碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非 特异性作用力，即疏水作用力和 Van der Waal力。
氨基酸（amino acid）是组成蛋白质的基本单位。组成人 体蛋白质的氨基酸仅有20种。
氨基酸的理化性质 1.两性解离及等电点：所有氨基酸都含有碱性的α-氨基和 酸性的α-羧基，因此氨基酸是一种两性电解质，具有两性解 离的特性。 2.紫外吸收性质 根据氨基酸的吸收光谱，含有共轭双键 的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近。
杂交示意图
四：Cot 曲线
在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓 度,t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA 顺序复杂性的 关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强 度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定,以不同程度的核酸 分子重缔合部分(在时间t时的复性率)取对数后对Cot作图,可以得到 如图所示的曲线,用非重复碱基对数表示核酸分子的复杂性。在 DNA总浓度(以核苷酸为单位)相同的情况下，片断越短，片断浓 度就越高，复性所需的时间也越短t1/2也越小 。
(1)加入能减弱疏水作用的试剂可以 消除碱基堆集作用。 (2)DNA样品加热时，碱基堆集作 用减少，同时伴随A260的增加。 (3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响．但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3．带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳 定。
影响DNA复性的因素
一：温度和时间。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的 最佳条件, 越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如 4℃以下)下,则不容易发生复性。 二：DNA浓度。复性的第一步是两个单链分子间的相互作用 “成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。 即溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。 三：DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和 多聚(U)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。
•DNA变性方法