同步荧光光谱法
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稳态测量 荧光测量
时间依赖的测量
4-4 时间分辨荧光法 （Time – Domain Fluorometry） (Time – Resolved Fluorometry）
一、时间分辨法原理
用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而衰 变，其衰变率为
dN (t) ( k)N (t)
dt
N(t) dN (t)
(1) 先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调 节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光 光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角。
(2) 使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相 角。
当用相灵敏检测器在各种不同检 测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱。 对于单一化合物，其荧光峰波长基本 上保持不变而与检测器相角无关。如 果不是均匀的发射，则荧光峰随着检 测器相角而改变，在不同检测器相角 得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发射 的有力工具。
（2） （3）
（2）同步扫描激发波长时的发射光谱
（3）同步扫描发射波长时的激发光谱
（3）同步荧光光谱的特点
a. 同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性， 因而使光谱分析的选择性得到改善。
b. 有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱 可以把强带增强而减小弱带的干扰。
如 i D 90，则该组分的发射被抑制 D A 90 F(,A 90 ) FB ()mB sin( B A) D B 90 F(,B 90 ) FA()mA sin( B A)
要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测 器相角调节至和组分B正交。这是很费时的， 最好得到另外的信息:
（1）测定荧光衰变曲线
Al – R Ga – R
10.8ns 4.3ns
6.5ns
可利用上述两个荧光化合物的差异 对它们进行同时测定。
（2）计算含量
铝配合物和镓配合物的 衰变曲线
铝配合物和镓配合物的 对数衰变曲线
比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量 比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量
em /nm
1、固定波长的同步荧光光谱
(Constant wavelength synchronous luminescence , CWSL)
(1) 在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持
固定的波长间距，即 em ex 常数。将
同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图， 则为固定波长的同步荧光光谱。
在不同相角 D测定荧光光谱，称为相
灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧 光光谱。
若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体，
它们的荧光寿命分别为A和B。
F(,t) FA()mA sin( t A) FBmB sin( t B )
F(,D ) FA()mA cos(D A) FB ()mB cos(D B )
Ray
Roman
固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描 过程中，使激发波长与发射波长之间保持着 固定的能量差。
( 1 1 ) 107 常数 ex em
表示波数差
c
与 成正比 拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移 R
R Ray Rom
例2 2-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料 溶剂 甘油 温度 A图 4℃ 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns
B图 57℃ 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns
4-5 相分辨荧光法 （ Frequency-Domain Fluorometry
/Phase-Modulation Fluorometry)
m 随 的增大而下降
m=1
发射光与激发光的调制幅度相同
m 越小 发射光被调制的幅度越小
随 的增大而增大，寿命越长，延迟的 越大。
当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟 的时间就越长。
2、多指数衰变的荧光
如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧 光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双指 数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数 衰变。
2、检测器 如光电倍增管 带有门控的
三、时间分辨荧光的分析应用
荧光体的荧光寿命的测定 时间分辨荧光光谱 荧光发射的衰变曲线
1、荧光体混合物中两组分的同时测定
例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga 15.20 ml 样品 + 1 ml 0.045% R +
2 ml 20% NH4Ac (or 20% NH4Cl ) 调 pH 至4.5，稀释至25 ml 氘灯激发 测定荧光强度—时间曲线
2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作
用所产生的芳基进行检测 （1）用25ps，266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘，
1-(溴甲基)萘， 2-(氯甲基)萘， 2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。 （2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激 发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm， 10ns，如图所示。
3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较 用于荧光参数测量的仪器可分为两大类
稳态测量 steady-state 时间依赖的测量 time dependent
相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上 都是时间依赖或时间分辨的测量。
（1）仪器 时间分辨荧光法的局限性
a. 仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用； b. 灵敏度常低于稳态测量。
2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描，需通过微处
理机控制而加以实现。
三、应用
1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠
（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃 的测定
苊(Ace )，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)， 苯并芘(Bap)， 苝(Per)
用标准加入法计算2,3-苯并芴
（2）低温固定能量同步荧光法
4-3 同步荧光光谱法 ( Synchronous Fluorescence)
一、同步荧光分析原理
同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发 射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由 测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图， 称为同步荧光光谱。
NOR. EX. SAN
ex
nm
NO FLUORE
NOR. EM. SCAN
由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。
如采用相灵敏检测器的相荧光计，
单一荧光体
F(t) 1 mLmsin( t )
mL — 激发光的调制度（或振幅） m — 去调制因素
对于相灵敏检测器
F(,D ) kF() cos(D )
F () — 稳态荧光光谱 D — 检测角度
当同时受瑞利和拉曼散射干扰
a e a e
d / 2
d
1 2
(r
e )
a — 测定波 r — 拉曼散射光的波长
2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL)
F (t )
lg
F0
(
lg
e)
荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的 1/e
所需要的时间。
特点： 采用适当的激发光源和检测体系，可以得
到在固定波长的荧光强度—时间曲线和在固定 时间的荧光发射光谱。
（1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组 分进行分辨；
（2）可消除杂质与背景荧光；
（3）可测量溶剂松弛的时间。
（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致 （b）和（d）一致，是2-萘甲基所致
3、溶剂松弛时间的分辨测量
许多分子在基态时具有从中等到大的偶极 矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围 溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶 质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛， 这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。
当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发 光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则 发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的时 间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了 角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些， 也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光 要小些。
m B / A Ba b / a Ab
当 R 或 R 时
固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉 曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利 散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂 性，提高选择性。
F a
b
c
二、同步扫描仪器设备
1、固定波长的荧光光谱的获得
对于以光栅为单色器的荧光分光光度计， 只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起 始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便 可进行固定波长同步扫描荧光测定。
( k)
t
dt
N0 N (t)
0
受激分子的寿命 ( k)1
t
N (t) N0e
t
t
F (t) N0e F0 e
用 F(t) 或 N(t) 对 t 作图
F(t) or N(t)
1/e
lg F (t)
or
lg N (t)
t
t
t
lg
在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向 长波位移。
时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱， 因而可测量松弛时间。
例1 4-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液 在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图
室温下， -132℃ 荧光光谱与时间t无关
在-77K，荧光光谱与t 有关 在 4ns， 溶剂还未重新取向 在23ns， 溶剂取向已完成
The objective of both time-domain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the time-resolved decay.
一、相分辨法原理
1、单指数衰变的荧光
二、时间分辨仪器设备 激发光源、时间延迟设备、激发单色器、 样品池、荧光单色器及设有门控的检测器
1、激发光源 短脉冲的激发光源
氮闪光灯
几条高强度射线
闪光灯 氢闪光灯 氘闪光灯
连续线 强度低
激光器
氮分子激光器 氩离子激光器 染料激光器
337.1 nm 351 nm 所需波长
光子通量大、峰值功率高、单色性好、发 生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有 较高的灵敏度和选择性。
— 去调制因素
激发光和发射光的光强正弦调制
tan
m
(1
2
2
)
1 2
在测量相角（）或去调制因素（m）之
后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相 分辨法是荧光寿命的测量方法之一。
、m与 的关系如下：
mBaidu Nhomakorabea
10 MHz 30 MHz
(ns)
30 MHz 10 MHz
(ns)
（2）定量依据
I S (ex , em ) KCb EX (ex )EM (em )
EX 激发光谱强度分布
（1）
EM 发射光谱强度分布
em ex
I S KCb EX (em )EM (em )
I S KCb EX (ex )EM (ex )
30nm or 70nm 的二阶导数同步荧光可对
Trp 和 Tyr 分辨
50nm 同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨
（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧
50nm
（5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定
100nm
总结：
c. 可消除 Raylei 干扰，使 Roman 强度降低 且拉宽。
（4） 的选择 只有当 恰好相当于某吸收带和其发射带之
间波长间距时，才能观察到同步信号。
= 斯托克斯位移 （发射波长与激发波长之差) 与狭缝宽度 d 的大致原则：
只受瑞利： a e d / 2
煤液化样品中各种有机物 的同步荧光光谱
煤液化样品的固定波长同步 荧光光谱
2、同步荧光法在医药检验方面的应用
（1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸 二乙酰胺的测定
（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽 5nm
（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠 CWSL
60nm 的同步荧光 色氨酸的光谱特征 15nm 的同步荧光 酪氨酸的光谱特征
时间依赖的测量
4-4 时间分辨荧光法 （Time – Domain Fluorometry） (Time – Resolved Fluorometry）
一、时间分辨法原理
用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而衰 变，其衰变率为
dN (t) ( k)N (t)
dt
N(t) dN (t)
(1) 先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调 节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光 光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角。
(2) 使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相 角。
当用相灵敏检测器在各种不同检 测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱。 对于单一化合物，其荧光峰波长基本 上保持不变而与检测器相角无关。如 果不是均匀的发射，则荧光峰随着检 测器相角而改变，在不同检测器相角 得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发射 的有力工具。
（2） （3）
（2）同步扫描激发波长时的发射光谱
（3）同步扫描发射波长时的激发光谱
（3）同步荧光光谱的特点
a. 同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性， 因而使光谱分析的选择性得到改善。
b. 有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱 可以把强带增强而减小弱带的干扰。
如 i D 90，则该组分的发射被抑制 D A 90 F(,A 90 ) FB ()mB sin( B A) D B 90 F(,B 90 ) FA()mA sin( B A)
要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测 器相角调节至和组分B正交。这是很费时的， 最好得到另外的信息:
（1）测定荧光衰变曲线
Al – R Ga – R
10.8ns 4.3ns
6.5ns
可利用上述两个荧光化合物的差异 对它们进行同时测定。
（2）计算含量
铝配合物和镓配合物的 衰变曲线
铝配合物和镓配合物的 对数衰变曲线
比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量 比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量
em /nm
1、固定波长的同步荧光光谱
(Constant wavelength synchronous luminescence , CWSL)
(1) 在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持
固定的波长间距，即 em ex 常数。将
同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图， 则为固定波长的同步荧光光谱。
在不同相角 D测定荧光光谱，称为相
灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧 光光谱。
若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体，
它们的荧光寿命分别为A和B。
F(,t) FA()mA sin( t A) FBmB sin( t B )
F(,D ) FA()mA cos(D A) FB ()mB cos(D B )
Ray
Roman
固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描 过程中，使激发波长与发射波长之间保持着 固定的能量差。
( 1 1 ) 107 常数 ex em
表示波数差
c
与 成正比 拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移 R
R Ray Rom
例2 2-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料 溶剂 甘油 温度 A图 4℃ 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns
B图 57℃ 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns
4-5 相分辨荧光法 （ Frequency-Domain Fluorometry
/Phase-Modulation Fluorometry)
m 随 的增大而下降
m=1
发射光与激发光的调制幅度相同
m 越小 发射光被调制的幅度越小
随 的增大而增大，寿命越长，延迟的 越大。
当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟 的时间就越长。
2、多指数衰变的荧光
如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧 光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双指 数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数 衰变。
2、检测器 如光电倍增管 带有门控的
三、时间分辨荧光的分析应用
荧光体的荧光寿命的测定 时间分辨荧光光谱 荧光发射的衰变曲线
1、荧光体混合物中两组分的同时测定
例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga 15.20 ml 样品 + 1 ml 0.045% R +
2 ml 20% NH4Ac (or 20% NH4Cl ) 调 pH 至4.5，稀释至25 ml 氘灯激发 测定荧光强度—时间曲线
2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作
用所产生的芳基进行检测 （1）用25ps，266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘，
1-(溴甲基)萘， 2-(氯甲基)萘， 2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。 （2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激 发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm， 10ns，如图所示。
3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较 用于荧光参数测量的仪器可分为两大类
稳态测量 steady-state 时间依赖的测量 time dependent
相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上 都是时间依赖或时间分辨的测量。
（1）仪器 时间分辨荧光法的局限性
a. 仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用； b. 灵敏度常低于稳态测量。
2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描，需通过微处
理机控制而加以实现。
三、应用
1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠
（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃 的测定
苊(Ace )，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)， 苯并芘(Bap)， 苝(Per)
用标准加入法计算2,3-苯并芴
（2）低温固定能量同步荧光法
4-3 同步荧光光谱法 ( Synchronous Fluorescence)
一、同步荧光分析原理
同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发 射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由 测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图， 称为同步荧光光谱。
NOR. EX. SAN
ex
nm
NO FLUORE
NOR. EM. SCAN
由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。
如采用相灵敏检测器的相荧光计，
单一荧光体
F(t) 1 mLmsin( t )
mL — 激发光的调制度（或振幅） m — 去调制因素
对于相灵敏检测器
F(,D ) kF() cos(D )
F () — 稳态荧光光谱 D — 检测角度
当同时受瑞利和拉曼散射干扰
a e a e
d / 2
d
1 2
(r
e )
a — 测定波 r — 拉曼散射光的波长
2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL)
F (t )
lg
F0
(
lg
e)
荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的 1/e
所需要的时间。
特点： 采用适当的激发光源和检测体系，可以得
到在固定波长的荧光强度—时间曲线和在固定 时间的荧光发射光谱。
（1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组 分进行分辨；
（2）可消除杂质与背景荧光；
（3）可测量溶剂松弛的时间。
（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致 （b）和（d）一致，是2-萘甲基所致
3、溶剂松弛时间的分辨测量
许多分子在基态时具有从中等到大的偶极 矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围 溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶 质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛， 这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。
当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发 光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则 发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的时 间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了 角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些， 也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光 要小些。
m B / A Ba b / a Ab
当 R 或 R 时
固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉 曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利 散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂 性，提高选择性。
F a
b
c
二、同步扫描仪器设备
1、固定波长的荧光光谱的获得
对于以光栅为单色器的荧光分光光度计， 只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起 始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便 可进行固定波长同步扫描荧光测定。
( k)
t
dt
N0 N (t)
0
受激分子的寿命 ( k)1
t
N (t) N0e
t
t
F (t) N0e F0 e
用 F(t) 或 N(t) 对 t 作图
F(t) or N(t)
1/e
lg F (t)
or
lg N (t)
t
t
t
lg
在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向 长波位移。
时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱， 因而可测量松弛时间。
例1 4-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液 在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图
室温下， -132℃ 荧光光谱与时间t无关
在-77K，荧光光谱与t 有关 在 4ns， 溶剂还未重新取向 在23ns， 溶剂取向已完成
The objective of both time-domain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the time-resolved decay.
一、相分辨法原理
1、单指数衰变的荧光
二、时间分辨仪器设备 激发光源、时间延迟设备、激发单色器、 样品池、荧光单色器及设有门控的检测器
1、激发光源 短脉冲的激发光源
氮闪光灯
几条高强度射线
闪光灯 氢闪光灯 氘闪光灯
连续线 强度低
激光器
氮分子激光器 氩离子激光器 染料激光器
337.1 nm 351 nm 所需波长
光子通量大、峰值功率高、单色性好、发 生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有 较高的灵敏度和选择性。
— 去调制因素
激发光和发射光的光强正弦调制
tan
m
(1
2
2
)
1 2
在测量相角（）或去调制因素（m）之
后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相 分辨法是荧光寿命的测量方法之一。
、m与 的关系如下：
mBaidu Nhomakorabea
10 MHz 30 MHz
(ns)
30 MHz 10 MHz
(ns)
（2）定量依据
I S (ex , em ) KCb EX (ex )EM (em )
EX 激发光谱强度分布
（1）
EM 发射光谱强度分布
em ex
I S KCb EX (em )EM (em )
I S KCb EX (ex )EM (ex )
30nm or 70nm 的二阶导数同步荧光可对
Trp 和 Tyr 分辨
50nm 同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨
（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧
50nm
（5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定
100nm
总结：
c. 可消除 Raylei 干扰，使 Roman 强度降低 且拉宽。
（4） 的选择 只有当 恰好相当于某吸收带和其发射带之
间波长间距时，才能观察到同步信号。
= 斯托克斯位移 （发射波长与激发波长之差) 与狭缝宽度 d 的大致原则：
只受瑞利： a e d / 2
煤液化样品中各种有机物 的同步荧光光谱
煤液化样品的固定波长同步 荧光光谱
2、同步荧光法在医药检验方面的应用
（1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸 二乙酰胺的测定
（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽 5nm
（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠 CWSL
60nm 的同步荧光 色氨酸的光谱特征 15nm 的同步荧光 酪氨酸的光谱特征