食品中呋喃唑酮的免疫层析试纸条快速检测方法研究

食品中呋喃唑酮的免疫层析试纸条快速检测方法研究
呋喃唑酮作为一种广谱抗生素被广泛地用于治疗大肠埃希菌和沙门氏菌属引起的胃肠道感染,并作为牛,猪和家禽的生长促进剂。

然而,有研究表明该药物的代谢物对人体有潜在的致癌、致畸和致突变等副作用。

欧盟,美国,中国等已经先后禁止此类药物的使用。

但是由于这种药物抗菌谱广,价格低廉,仍经常被不法分子滥用。

因此,建立一种灵敏度高的现场快速检测方法来监测这种现象具有很重要的现实意义。

呋喃唑酮半衰期短,在动物体内排泄快速,而其代谢产物3-氨基-2-恶唑酮（AOZ）却可以与动物组织中蛋白质紧密结合而长期存在于机体内,因此通过检测AOZ来监测其原药的滥用。

为检测不同食品体系中AOZ的残留,本研究以其衍生物CPAOZ为目标物,构建了三种免疫层析快速检测方法,实现了多种食品样品中AOZ的高灵敏检测。

本论文的研究内容及结果如下:（1）抗CPAOZ单克隆抗体的制备及性能鉴定:采用对小鼠腹腔注射的方法制备抗CPAOZ单克隆抗体腹水,纯化可得抗CPAOZ单克隆抗体,结果表明抗体纯度高,效价为
1:128000,与抗原亲和力强,IC₅₀为2
ng·mL^-1,灵敏度高。

（2）基于纳米金双标记信号放大的CPAOZ免疫层析快速检测试纸条的构建及性能鉴定:首先制备了传统的免疫层析快速检测试纸条,以纳米金为抗体标记材料,确定了金标抗体的最佳制备条件,试纸条对CPAOZ的肉眼检测灵敏度为5 ng·mL^-1。

利用抗体和二抗的识别作用,合成了金标抗体和金标二抗两种复合物,以金标抗体作为检测探针,金标二抗作为信
号放大剂,将两者均喷涂于同一个结合垫上以简化分析系统。

当两种复合物被先后洗脱下来后,在单抗和二抗的特异性识别作用下,大量的纳米金聚集在一起,形成了复杂的网状信号放大结构,从而加深了在检测线上的显色。

另一方面,增强的信号使试验中所需的抗体量减少,使得抗原和小分子检测物之间的竞争反应更加激烈,进一步提高了分析灵敏度。

该方法对CPAOZ的肉眼检测灵敏度为1
ng·mL^-1,相对于传统纳米金试纸条降低了5倍。

采用该试纸条对五种食品样品（奶粉,虾,鸡肉,鱼和猪肉）中的AOZ残留进行检测,结果表明,试纸条对样品中AOZ的检测限仍能达到1 ng·mL^-1,说明该方法可以很好地应用于实际样品中AOZ 残留的检测。

（3）基于结晶紫染色的CPAOZ免疫层析快速检测试纸条的构建及性能鉴定:在本研究中,首先采用结晶紫将抗体进行一步法染色标记,之后与抗原结合。

优化后确定结晶紫浓度0.05%、标记探针体积120μL、孵育时间4 min为最佳检测条件。

该方法对CPAOZ 的肉眼检测灵敏度为7 ng·mL^-1,虽未明显提高分析灵敏度,但是该方法以简单的结晶紫染色提供信号,代替了复杂的纳米材料标记。

与传统方法相比,该方法不但避免了信号材料的合成,而且简化了信号探针的制备过程,在保证检测性能的同时又简化了方法的构建过程、降低了分析成本。

另外,其它CPAOZ类似物对试纸条检测线的显色无明显抑制,特异性强,可成功应用于虾、鱼和猪肉样品中AOZ的污染检测。