质粒DNA的提取和鉴定

质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。
以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件
5‘AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇 的诱导下可启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序 列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于 外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插 入提供位点；
序列的查询与获得
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
输入基因名称
选择查询项目
点击“Go”
注意选择人属物种的基因
mRNA序列 蛋白Βιβλιοθήκη Baidu序列
基因组序列
运行DNAstar软件
点击“OK”
选取编码区序列
密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html
成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是
为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须 温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸 钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠 离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2 M的醋酸是为了中和NaOH， 因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。
第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段 序列的生物信息学分析
质粒的基本知识
载体（vector）：能携带外源DNA进入细胞的运载DNA分子。载体按其行使的功 能分为克隆载体和表达载体，按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、 病毒载体等。 质粒（plasmid）大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状 结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相 容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其 在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。
第二部分，质粒DNA的提取与鉴定
实验目的
掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA释放法；酸酚法等。 碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理
综合性设计性实验-6
质粒载体的选择以及所插入的外源DNA 片段序列的生物信息学分析 质粒DNA的提取与鉴定 真核表达载体和RNA干扰载体的使用
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源 DNA片段序列生物信息学分析部分 2. 3. 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用
输入DNA序列
得到的分析结果
启动子区的分析
http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
CpG岛分析
http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2943
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；
HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同 源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表 达载体在 E.coli 中筛选和复制。
根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细 菌内大量复制，得到大量的重组质粒。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要 取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验 要求。
碱裂解法基本原理
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部， EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金 属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制 DNase的活性，避免 质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形
常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19
表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目 的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。
常用的表达载体：
原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin
质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记
可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在
含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白 和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分 随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载 工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。