耐药机制及模式

乙型肝炎病毒核苷（酸）类似物耐药的机制
发表者：阮连国 (访问人次：290)
过去十年，国内批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物已从一种普通干扰素增加到包括聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定在内的6种药物，国外还有替诺福韦酯以及恩曲他滨。

尽管核苷（酸）类药物与干扰素相比服用方便，副作用少，但在48周疗程结束停药后，往往不能获得病毒持续抑制而延长疗程，甚至可能是无限期的。

长期应用该类药物可伴有病毒耐药风险的增加，病毒耐药及患者依从性差是导致慢性乙型肝炎抗病毒治疗失败的两个最重要原因。

核苷(酸)类药物治疗失败分为原发性治疗失败（初始治疗无应答）和继发性治疗失败，所谓原发性治疗失败，是指在开始抗病毒治疗后三个月内，血清乙型肝炎病毒（HBV） DNA浓度下降小于1× log 10 IU/ml；而继发性治疗失败则被定义为初始抗病毒治疗有效（三个月内，血清HBV DNA浓度下降大于或等于1×log10 IU/ml），但一段时间后病毒反跳，血清HBV DNA浓度比治疗中最低值升高大于或等于1×log10 IU/ml。

病毒变异及耐药是继发性治疗失败的最重要的原因。

一、乙型肝炎病毒复制特点及其变异的产生
在HBV DNA的复制过程中，需要经过一个逆转录的过程，由于病毒逆转录酶缺乏3’-5’核酸外切酶活性，所以无法对错配的核苷(酸)酸进行校读,导致HBV DNA的天然复制错误率比其他DNA病毒高10倍左右。

HBV基因在复制过程中不断产生天然变异，从而在未经治疗的HBV感染者体内常常形成一群基因序列十分相似、但不完全等同的病毒株组成的准种（quasispecies）。

由于HBV DNA的重叠读框特点，大部分的HBV DNA准种会导致其复制能力的下降，在特定环境下的优势株就是在特定选择压力下复制能力最强的准种。

内源性（宿主免疫应答）和外源性（抗病毒药物或病毒传播过程）选择压力下的HBV变异株（准种）池的存在为HBV提供了生存优势，使得其在免疫应答（前C区或e抗原逃逸）、预防性疫苗（疫苗逃逸）和抗病毒药物（病毒耐药）前就存在变异逃逸株。

HBV对抗病毒药物的耐药反映了病毒对于药物抑制敏感性的下降，缘于药物选择性压力下病毒的适应性变异。

已经确定了两种类型的耐药变异：主要耐药变异和代偿性耐药，前者直接降低病毒对药物的敏感性，而后者则可能增强病毒的复制能力，因为主要耐药变异往往伴随着病毒复制适应性的降低。

代偿性耐药变异的重要性在于它能在准种记忆的基因库里弥补耐药变异株的缺陷。

耐药变异株出现的标志包括病毒载量的上升，一般从最低点升高大于1logIU/ml，和（或）病毒多聚酶区出现已知的基因耐药标志，血清谷丙转氨酶的升高以及最终临床症状的恶化。

二、乙型肝炎病毒耐药产生的相关因素
HBV耐药的发展至少取决于以下六个因素：（1）病毒复制的数量和速率；（2）病毒聚合酶的保真性；（3）药物的选择压力；（4）肝脏复制空间总量；（5）耐药病毒株的复制适应性；（6）药物的基因屏障。

1、病毒复制的数量和速率 HBV高复制导致的病毒高更新率使得慢性感染者血清中的循环病毒浓度
常常大于108—1010病毒颗粒/毫升。

假定循环中的病毒半衰期为一天，每天新产生的病毒颗粒也要
超过1011 。

HBV基因组有3200个碱基对，聚合酶错配率为10-4至10-5/碱基/循环，这便导致了循环病毒总体中含有大量带有突变的基因组（准种），因此每天每个碱基都可能发生变化。

然而,HBV 基
因组中以读框移位方式重叠的ORF 结构可限制最终产生的有活力的突变体的数量。

HBV 准种池中优
势株的稳定性维持有赖于来自宿主固有免疫和适应性免疫系统的特定的选择压力以及病毒本身的生
存和复制能力。

2、病毒聚合酶的保真性 HBV突变率大约为1.4至3.2×10-5氨基酸置换/位点/年，约为其他DNA病毒的10倍，与RNA病毒如逆转录病毒一致。

与细胞聚合酶不同，HBV聚合酶是逆转录酶，缺少校
正活性。

由于HBV准种池的存在，在进行抗病毒治疗之前，就有可能存在带有一个或两个与耐药有
关突变的变异株。

3、药物的选择压力治疗过程中选择出耐药相关变异的几率取决于药物的效力，这种几率可以用钟
形曲线来表示。

低抗病毒效力的药物并不会对病毒施加明显的选择压力，耐药株出现的风险也不高。

反之，由于变异依赖病毒复制，因此，彻底抑制病毒复制的药物也几乎不给变异产生的机会。

由于
单药疗法只在单一的靶位点不同程度地发挥抗病毒作用，所以它有着较高的机率选择出耐药变异。

理想的治疗方案能在病毒生命周期的不同阶段抑制病毒，从而显著减少耐药发生的风险。

在药物选
择压力存在的情况下,只有病毒复制存在才可发生耐药。

4、肝脏复制空间总量 HBV的复制空间是指肝脏容纳新的转录模板或cccDNA分子的潜力。

这表明
病毒变异株的最终接收依赖于原始野生病毒株的损耗，并受着其他因素如病毒复制适应性和肝细胞
的增殖和更新的影响。

在正常肝脏中，肝细胞的更新很慢，半衰期约为100天。

在炎症活动和中毒时，半衰期会减少到10天以下。

在完全感染的肝脏中,新生的HBV cccDNA 分子只有在生成未感染
的肝细胞时才可合成,而未感染的肝细胞可通过肝脏的正常生长、肝细胞的增殖和更新或感染的肝细
胞中野生型病毒的cccDNA 的消耗而获得。

5、耐药病毒株的复制适应性复制适应性可定义为在自然选择压力下生成子代的能力,它不以产量来衡量病毒复制能力,而是通过体外共感染竞争试验来测定,但是这一方法不适用于HBV ,因为缺乏针对HBV 感染的适合的细胞培养系统。

有临床研究显示了对拉米夫定耐药HBV 的复制适应性。

Thibault
等首先报道了对拉米夫定耐药HBV 在患者之间的传播性;另一些研究小组发现在停药后至少三个月,
拉米夫定耐药株可作为共同优势株与野生型HBV 共存,而在停药约一年后,则作为非优势株与野生型HBV 共存。

6、基因屏障核苷（酸）类药物的基因屏障是指主要耐药变异所需核苷酸突变的数目。

对左旋核苷
类如LMV和无环硫酸盐类药物如ADV,只需一个突变。

例如，rtM204I导致LMV耐药而rtN236T造
成ADV耐药。

对环戊烷类成员ETV来说，至少需要3个变异：rtM180L和rtM204I加上rtI169、rtS 184、rtS202和rtM250中的一个。

7、其他因素影响抗病毒治疗的宿主因素包括过往用药史、顺应性、宿主基因因素（如先天性代谢缺陷）和通过一系列细胞内磷酸化（肝细胞内的补救酶类）有效地将核苷类药物转化为其活性代谢物的能力。

另外，有一些隐匿的场所可能是抗病毒药物效力无法达到的，而作为HBV关键的复制中间体，cccDNA一般对常规疗法不敏感。

三、不同核苷（酸）类药物的特异耐药模式
目前国内已上市的药物一类是左旋脱氧胞苷类似物包括拉米夫定（LMV）、替比夫定（LdT）；第二类为无环磷酸盐类，阿德福韦酯（ADV）；第三类为环戊烷类药物，其中包括脱氧鸟苷类似物恩替卡韦（ETV）。

之所以强调其化学分类，是因为这可能影响核苷（酸）类药物耐药的模式和通路。

LMV耐药变异 LMV耐药变异位点在HBV聚合酶的催化区或称为C区的YMDD序列上。

LMV治疗过程中选择出的主要耐药变异位点在RT区，rtM204I/V/S（C区）伴或不伴rtM180L （B区）。

其他耐药变异包括rt181T/V。

代偿性变异发生在HBV聚合酶的其他区域，如rtL80V/I,rtV173L和rtT184 S。

在拉米夫定的治疗过程中,其耐药发生率以每年14 %到32 %的速度递增。

LMV最主要的耐药变异rtM204V/I与LDT有交叉耐药性，而与ADV无交叉耐药性，但rtA181T则有交叉。

值得注意的是rtM204V/I会降低对ETV的敏感性。

在体外实验中，LMV相关的耐药变异使得病毒对LMV的敏感性下降了至少100倍甚至超过1000倍。

rtM204I突变可单独存在，而rtM204V和rtM204S只伴随着A 或B区的其它突变出现。

拉米夫定耐药的分子机制是聚合酶YMDD 基序中的蛋氨酸被缬氨酸或异亮氨酸替换后，其ß-甲基造成了拉米夫定三磷酸盐结合空间的减少，形成空间阻碍，从而阻止拉米夫定三磷酸盐与HBV聚合酶的结合。

LDT耐药变异替比夫定为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的L-对映体，耐药位点与拉米夫定相似，都发生在YMDD区，rtM204I替换是最常发生的变异。

ADV耐药变异最初发现阿德福韦酯耐药与聚合酶B 区rtA181T和D 区N236T 突变有关。

阿德福韦耐药变异较LMV耐药少见，用药两年后的耐药发生率约为2﹪，三年4﹪，四年18﹪而五年则达到了29﹪。

rtN236T 不会显著影响病毒对拉米夫定的敏感性,但rtA181T/V突变株可与拉米夫定发生部分交叉耐药。

逆转录酶区的另一个变异（rtI233V）也被证实与ADV耐药相关。

临床研究显示，在所有的CHB病人中，有近2﹪发生了rtI233V变异，但此变异在ADV治疗失败或无应答中的确切作用目前还不明确。

ETV耐药变异恩替卡韦耐药最初只在对拉米夫定耐药的病人中出现,其耐药的出现与病毒聚合酶基因的突变有关,主要是B 区rtI169T或rtS184G,C 区rtS202I 和E 区rtM250V。

未出现拉米夫定耐药时, rtM250V 可使IC50 增加9 倍, 而rtT184G + rtS202I 没有这种作用；而在存在rtL180M和rtM20 4V变异时，IC50可增加超过100倍。

最近有报道称在初治患者中发现了ETV原发性耐药变异。

对初治患者恩替卡韦第一年的耐药发生率非常低，而五年也不过1.3﹪。

然而，对曾经接受过拉米夫定的病人来说，改用恩替卡韦后四年的耐药率高达40﹪。

rtT184G合并rtS202I 变异的耐药机制是其
构象变化,包括核苷酸结合区的几何学改变和位于YMDD 基序附近的聚合酶与模板DNA 相结合的改变。

rtM250V 耐药的分子机制是DNA 模板链、引物链以及新参入的dNTP 之间相互结合的改变。

四、聚合酶区和S区的基因重叠所导致的问题
HBV病毒外膜（S抗原）基因完全重叠在聚合酶基因中，因此核苷（酸）类药物耐药变异会导致S 抗原的改变。

聚合酶和S抗原的基因重叠之所以重要，是因为普通的拉米夫定耐药变异株如（rtV17 3L+rtL180M+rtM204V）的S抗原有着重要而显著的改变（sE164D+sI195M）,从而导致体外实验中其与S抗体（疫苗相关性）的结合力明显下降。

同样，在阿德福韦治疗失败患者中，超过40﹪的病例中可发现rtA181T单独或伴随rtN236T出现。

Rt区的rtA181T变异可导致与其重叠的S抗原出现Sw172（终止密码子）改变。

Warner和Locarnini等发现此种HBV变异株有分泌功能缺陷，病毒颗粒被滞留在细胞内，而且此变异能抑制HBV野生株病毒颗粒的分泌。

这些研究的临床意义在于病毒学上的耐药定义（在连续两次间隔超过一个月的样本中，HBV DNA从最低点上升超过1logIU/ML）在此种变异株被（共）选择出来时不再适用。

rtA181T出现后，病毒载量只是在12个月内从最低点逐渐上升。

因此，在患者接受抗病毒治疗时，除了需要观察病毒载量，还应该进行基因分型和聚合酶区测序。

结语
HBV对核苷(酸)类药物耐药的实质上是在药物选择压力下，HBV准种中的变异株的筛选，由于 cccD NA的长半衰期及被感染肝细胞的长寿命，导致慢性乙型肝炎患者需要长期的治疗及监测，在此期间应选择适宜的药物和治疗方案，预防或减少病毒耐药变异株出现，提高抗病毒的疗效。

目前已出现的HBV聚合酶区耐药变异模式十分复杂，众多代偿性变异的出现，使得后续的补救治疗不得不选择折中的策略。

如何正确看待病毒载量、HBV的基因型以及聚合酶区的序列测定结果都需要进一步研究，也非常需要可用的和更广泛的交互式数据库程序为补救治疗提供依据。

如果病毒复制能被长期有效抑制,病毒载量将降至不可能出现新耐药病毒准种的程度。

基因型耐药与表型耐药的区别
基因型耐药是指病毒聚合酶基因突变，形成新的病毒基因序列，一般采用DNA测序、基因芯片等方法测定。

表型耐药是指在治疗期间病毒水平上升，一般用抗病毒药物浓度(IC50)测定，IC50增加说明药物敏感性下降或耐药程度增加，需要更大的药物剂量才能抑制变异的病毒。

表型耐药另一含义指HBV DNA水平>106copies/ml，伴有ALT水平升高，而基因型耐药指HBV DNA水平103 ~ 106copies/ml，ALT水平正常。