荧光光谱的原理与应用课件
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【精品】第5章荧光光谱.PPT课件
伴随电子自旋的改变。（ ）
结束语
谢谢大家聆听！！！
28
吸收光谱与荧光强度（激发的选择？）
➢ 吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下 跃迁产生的荧光越强
强度
吸收光谱
强度
荧光光谱
波长
波长
5.2 荧光探测
5.2.1 荧光探测装置
两点区别： 1. 在入射光的垂直方向探测 2. 探测器前还有一个单色器
吸收光谱 荧光光谱
F-4500荧光光度计光路图（日立）
增强型绿色荧光蛋白 509 nm
四甲基罗丹明 576 nm
染料 667 nm
染料cy3的吸收、发射光谱
最大激发波长 550 nm 最大发射波长 570 nm (黄绿光)
绿色荧光蛋白（GFP）
➢ GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用 的活体报告蛋白
5.2.3 荧光探测方法
➢ 同步荧光光谱技术
常用有机荧光试剂
待测离子 Al3+，Fe-
B4O22Sn4+ Li+
荧光试剂 茜素紫酱R
苯偶姻 黄烷醇 8-羟基喹啉
吸收波长 470 nm 370 nm 400 nm 370 nm
荧光发射波长 500 nm 450 nm 470 nm 580 nm
5.3.2 有机物分析
➢ 脂肪族有机化合物
具有高度共轭体系的或脂环化合物能发射荧光，维生素A、萝卜素 结构简单的脂肪族化合物本身能发射荧光的不多，需与有机试剂形成 荧光化合物，可参考讲义中“荧光分析法测定丙三醇”的例子
5.1.4 影响荧光光谱的因素（外部）
➢ 入射光强，荧光强度与入射光强成正比 ➢ 溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
X荧光光谱法(XRF)课件PPT
与其他分析方法相比，X荧光光谱法具 有较高的检测精度和稳定性，操作简 便，对环境和人员无害，尤其适用于 现场快速分析和在线检测等领域。
02 X荧光光谱法的基本原理
原子结构与能级跃迁
01
02
03
原子结构
原子由原子核和核外电子 组成，电子在不同能级上 运动。
能级跃迁
当原子受到外界能量（如 光子）的激发时，电子从 低能级跃迁到高能级，反 之亦然。
环境样品分析
总结词
X荧光光谱法在环境样品分析中具有独特的优势，能够同时测定多种元素，且对样品的 前处理要求较低。
详细描述
X荧光光谱法可用于水质检测，如测定水体中的重金属离子和溶解氧等；还可用于大气 颗粒物分析，了解空气污染物的来源和分布情况。
考古样品分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
总结词
详细描述
X荧光光谱法在考古样品分析中具有重要作 用，能够快速准确地测定文物中的元素组成， 为文物鉴定和保护提供依据。
现状
随着科技的不断进步，X荧光光谱仪器的性能不断提升，检测精度和稳定性不断 提高，同时新型的仪器和应用也不断涌现，如便携式X荧光光谱仪、在线X荧光 光谱仪等。
特点与优势
特点
X荧光光谱法具有非破坏性、快速、 多元素同时分析等特点，能够同时检 测物质中多种元素的含量，且对样品 形状和大小要求不高。
优势
化合物分析
总结词
X荧光光谱法不仅可以检测元素，还可以对化合物进行分析。
详细描述
通过测量不同元素荧光谱线的能量和强度，可以对化合物的类型和结构进行分析。该方法在化学、制药、生物等 领域有广泛应用，可用于药物成分分析、生物组织成分分析等。
样品制备与处理
总结词
为了获得准确的X荧光光谱分析结果，需要对样品进行适当的制备与处理。
02 X荧光光谱法的基本原理
原子结构与能级跃迁
01
02
03
原子结构
原子由原子核和核外电子 组成，电子在不同能级上 运动。
能级跃迁
当原子受到外界能量（如 光子）的激发时，电子从 低能级跃迁到高能级，反 之亦然。
环境样品分析
总结词
X荧光光谱法在环境样品分析中具有独特的优势，能够同时测定多种元素，且对样品的 前处理要求较低。
详细描述
X荧光光谱法可用于水质检测，如测定水体中的重金属离子和溶解氧等；还可用于大气 颗粒物分析，了解空气污染物的来源和分布情况。
考古样品分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
总结词
详细描述
X荧光光谱法在考古样品分析中具有重要作 用，能够快速准确地测定文物中的元素组成， 为文物鉴定和保护提供依据。
现状
随着科技的不断进步，X荧光光谱仪器的性能不断提升，检测精度和稳定性不断 提高，同时新型的仪器和应用也不断涌现，如便携式X荧光光谱仪、在线X荧光 光谱仪等。
特点与优势
特点
X荧光光谱法具有非破坏性、快速、 多元素同时分析等特点，能够同时检 测物质中多种元素的含量，且对样品 形状和大小要求不高。
优势
化合物分析
总结词
X荧光光谱法不仅可以检测元素，还可以对化合物进行分析。
详细描述
通过测量不同元素荧光谱线的能量和强度，可以对化合物的类型和结构进行分析。该方法在化学、制药、生物等 领域有广泛应用，可用于药物成分分析、生物组织成分分析等。
样品制备与处理
总结词
为了获得准确的X荧光光谱分析结果，需要对样品进行适当的制备与处理。
荧光光谱的原理及应用
荧光探针在药物筛选中的应用
荧光探针也可用于药物筛选过程中，通过标记特定的靶点或 受体，观察药物与靶点或受体之间的相互作用。这种方法有 助于加速新药研发过程，提高药物筛选的效率和准确性。
荧光光谱在环境监测中的实际应用案例
荧光光谱在水质监测中的应用
荧光光谱技术可用于检测水体中的有机污染物，如农药、石油和工业废水等。通过分析水样中的荧光光谱，可以 确定污染物的种类和浓度，为环境保护和治理提供科学依据。
计算机
处理和显示测量数据，控制光 谱仪的操作。
荧光光谱的测量步骤
准备样品
选择适当的荧光物质 样品，并进行必要的 处理和纯化。
安装样品
将样品放入样品池中， 并确保激发光能够照 射到样品上。
调整仪器
根据实验需求，调整 激发光源、单色仪和 检测器的参数。
பைடு நூலகம்
进行测量
启动光谱仪，测量荧 光物质在不同波长下 的荧光强度。
热能等形式散失。
荧光光谱的形状可以反映荧光 物质的分子结构和环境因素，
如溶剂极性、温度等。
02
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量方法
发射光谱法
通过测量荧光物质发射的光谱，确定荧光物 质的结构和组成。
吸收光谱法
通过测量荧光物质吸收的光谱，研究荧光物 质的能级结构和跃迁过程。
时间分辨光谱法
通过测量荧光物质在不同时间点的光谱，研 究荧光物质的动态过程和寿命。
荧光光谱法可用于研究聚合物的 荧光性质，如荧光量子产率、荧 光寿命等，有助于聚合物的性能 研究和质量控制。
在生物学研究中的应用
生物分子的荧光标记
荧光光谱法可用于标记生物分子，如蛋白质、核酸等， 以研究其结构和功能。
细胞成像
荧光探针也可用于药物筛选过程中，通过标记特定的靶点或 受体，观察药物与靶点或受体之间的相互作用。这种方法有 助于加速新药研发过程，提高药物筛选的效率和准确性。
荧光光谱在环境监测中的实际应用案例
荧光光谱在水质监测中的应用
荧光光谱技术可用于检测水体中的有机污染物，如农药、石油和工业废水等。通过分析水样中的荧光光谱，可以 确定污染物的种类和浓度，为环境保护和治理提供科学依据。
计算机
处理和显示测量数据，控制光 谱仪的操作。
荧光光谱的测量步骤
准备样品
选择适当的荧光物质 样品，并进行必要的 处理和纯化。
安装样品
将样品放入样品池中， 并确保激发光能够照 射到样品上。
调整仪器
根据实验需求，调整 激发光源、单色仪和 检测器的参数。
பைடு நூலகம்
进行测量
启动光谱仪，测量荧 光物质在不同波长下 的荧光强度。
热能等形式散失。
荧光光谱的形状可以反映荧光 物质的分子结构和环境因素，
如溶剂极性、温度等。
02
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量方法
发射光谱法
通过测量荧光物质发射的光谱，确定荧光物 质的结构和组成。
吸收光谱法
通过测量荧光物质吸收的光谱，研究荧光物 质的能级结构和跃迁过程。
时间分辨光谱法
通过测量荧光物质在不同时间点的光谱，研 究荧光物质的动态过程和寿命。
荧光光谱法可用于研究聚合物的 荧光性质，如荧光量子产率、荧 光寿命等，有助于聚合物的性能 研究和质量控制。
在生物学研究中的应用
生物分子的荧光标记
荧光光谱法可用于标记生物分子，如蛋白质、核酸等， 以研究其结构和功能。
细胞成像
荧光光谱法PPT课件
否 则 能量以无辐射跃迁形式释放（内转换 与外转换的速度很快） →无荧光发射
25
第25页/共57页
基本原理
2. 影响荧光强度的结构因素 （内部因素）
1）跃迁类型 2）共轭效应（长共轭结构） 3）刚性结构与共平面性效
应 4）取代基效应
26
第26页/共57页
基本原理
1）跃迁类型 • 分子结构中存在共轭的π→π*跃迁，也就是K
第11页/共57页
基本原理
1. 激发光谱和发射光谱 （excitation spectrum and emission
spectrum）
固定发射波长 扫描激发波长
不同激发 波长引起 某一波长 荧光发射 相对效率
荧光：
先激发 后发射
激发 光谱
发射 光谱
固定激发波长 扫描发射波长
发射荧 光中各 波长相 对强度
比值不变 灵敏度不变
51
第51页/共57页
分析方法
2. 定量分析方法 1. 标准曲线法 2. 比例法（对比法、一点外标法）
类似于UV-Vis
3. 多组分混合物的荧光分析 4. 差示荧光法
52
第52页/共57页
分析方法
相同点
FL与UV比较
λ区段：UV-Vis区
适用性：均可用于定性定量，多用于定量
定量方法：相似
15
第15页/共57页
基本原理
1）斯托克斯位移（Stokes shift, 1852年） • 溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大
于激发光谱波长的现象 • 说明在激发与发射之间存在能量损失
振动弛豫 内部转换
16
第16页/共57页
基本原理
2）荧光光谱形状与λex无关
25
第25页/共57页
基本原理
2. 影响荧光强度的结构因素 （内部因素）
1）跃迁类型 2）共轭效应（长共轭结构） 3）刚性结构与共平面性效
应 4）取代基效应
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基本原理
1）跃迁类型 • 分子结构中存在共轭的π→π*跃迁，也就是K
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基本原理
1. 激发光谱和发射光谱 （excitation spectrum and emission
spectrum）
固定发射波长 扫描激发波长
不同激发 波长引起 某一波长 荧光发射 相对效率
荧光：
先激发 后发射
激发 光谱
发射 光谱
固定激发波长 扫描发射波长
发射荧 光中各 波长相 对强度
比值不变 灵敏度不变
51
第51页/共57页
分析方法
2. 定量分析方法 1. 标准曲线法 2. 比例法（对比法、一点外标法）
类似于UV-Vis
3. 多组分混合物的荧光分析 4. 差示荧光法
52
第52页/共57页
分析方法
相同点
FL与UV比较
λ区段：UV-Vis区
适用性：均可用于定性定量，多用于定量
定量方法：相似
15
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基本原理
1）斯托克斯位移（Stokes shift, 1852年） • 溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大
于激发光谱波长的现象 • 说明在激发与发射之间存在能量损失
振动弛豫 内部转换
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基本原理
2）荧光光谱形状与λex无关
8 荧光光谱的原理及应用
蒽在溶液中的吸收（虚线） 和发射（实线）光谱 16
斯托克位移 产生斯托克位移的主要原因：
1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速 率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量，
达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；
2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到
的光激发苯， = 0.4，而当以小于240 nm的光激发苯时，则未检测
到荧光。这是由于苯的高振动能级的S1态会使其转变为杜瓦苯。不同 化合物的差别可以很大。
另外，还会受环境（如温度、溶剂等）的影响，例如，降低温度 可导致一个化合物的增大，提高温度可导致一个化合物的降低。
31
量子产率
由于荧光的非单色性、各向的不均匀性和二级发射等原因，荧光量
12
辐射跃迁失活的途径
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为
S1 → S0跃迁），发射波长为 l’2的荧光； 10-7～10-9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l ’2 > l
2
> l
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（ 多为
T1 → S0跃迁）；发射波长为 l3 的磷光； 10-4～100 s 。
寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比。
因此有
F 1/KF
F表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射速率的衰减常数。
荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数。
25
荧光寿命
处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一 些其它过程 (如淬灭和能量转移 ) 回到基态，其结果是加快了激发态 分子回到基态的过程(或称失活过程)，结果是荧光寿命降低。
【优质】荧光光谱仪原理及其使用方法PPT
功能强大、操作简便的软件系统
功能： ➢激发光谱、荧光、同时光谱测定 ➢定量分析（１－３次标准曲线） ➢时间扫描—动力学
检索最佳的激发光和荧光波长
➢只需打开
自动检索最佳激发光和荧光波长
➢从瑞利散射、拉曼散射及２次光中自动判断出荧光
➢使复杂的波长设置简单化
多样的数据处理
使复杂的波长设置简单化 瑞利、拉曼散射和2次光
➢化学发光：当 2 种化学物质混合后给出的光.
➢.荧光素酶，导致发光. 类似化学发光，两种生 物化学物质混合产生光.
分子吸收、荧光、磷光辐射跃迁
无辐射跃迁——去活化过程
处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活 化过程返回至基态 。这些过程包括： 1）振动弛豫
在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰 撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失 活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2）内转换
恒温水循环装置
使用温度范围：室温—85 0C 温度调节精确度：+0.05 0C 泵的流量：最大15L/18L/min(50/60Hz) L
恒温四连池架
利用恒温水的循环，一次可使4个 样品池恒温化。
适用的温度范围：5 0C--80 0C
微量样品池装置
取400ul的少量试样就能测定。 试样可以放入与四面研磨样 品池大小（10mm)的槽中，
吸收光谱是由基态最低振动能层
跃迁到第一电子激发单重态的各个振
动能层而形成，即其形状与第一电子
激发单重态的振动能级分布有关。
由于激发态和基态的振动能层分
布具有相似性，因而呈镜像对称。
S1 荧光
S0
产生荧光的条件
i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
荧光光谱分析法课件
详细描述
通过观察化学反应过程中荧光强度的变化，可以了解反应过程中各组分的浓度变化，从而推算出反应速率常数和 反应机理等信息。
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
2. 在不同时间点测量荧光 光谱并记录数据。
1. 选择适当的荧光标记的 化学反应体系。
实验步骤
01
03 02
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
总结词
荧光光谱法可用于研究生物大分子间的相互作用，如蛋白质蛋白质、DNA-蛋白质等相互作用。
详细描述
荧光光谱法通过观察荧光标记的生物大分子在相互作用前后 的光谱变化，可以了解生物大分子间的结合方式、亲和力以 及作用机制等信息。
利用荧光光谱法研究生物大分子的相互作用
实验步骤
1
2
1. 将荧光标记的生物大分子进行纯化和制备。
荧光光谱分析法课件
目录 CONTENT
• 荧光光谱分析法概述 • 荧光光谱分析法的基本原理 • 荧光光谱分析法的实验技术 • 荧光光谱分析法的数据处理与分
析 • 荧光光谱分析法的实验案例 • 荧光光谱分析法的展望与未来发
展
01
荧光光谱分析法概述
定义与原理
定义
荧光光谱分析法是一种基于物质吸收 光能后发射荧光特性进行物质成分和 结构分析的方法。
激发态的衰变
电子从激发态返回基态时，以辐射或非辐射方式释放能量，产生荧 光光谱。
荧光光谱的产生机制
荧光光谱是由分子吸收光能后，通过内部转换、振动弛豫和辐射跃 迁等过程产生的。
荧光光谱的组成与特征
荧光光谱的组成
荧光光谱由发射峰、激发峰和斯托克斯位移组成。
荧光光谱的特征
荧光光谱的特征与分子结构、环境因素和激发波长等有关，可用于分析分子的 结构和性质。
通过观察化学反应过程中荧光强度的变化，可以了解反应过程中各组分的浓度变化，从而推算出反应速率常数和 反应机理等信息。
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
2. 在不同时间点测量荧光 光谱并记录数据。
1. 选择适当的荧光标记的 化学反应体系。
实验步骤
01
03 02
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
总结词
荧光光谱法可用于研究生物大分子间的相互作用，如蛋白质蛋白质、DNA-蛋白质等相互作用。
详细描述
荧光光谱法通过观察荧光标记的生物大分子在相互作用前后 的光谱变化，可以了解生物大分子间的结合方式、亲和力以 及作用机制等信息。
利用荧光光谱法研究生物大分子的相互作用
实验步骤
1
2
1. 将荧光标记的生物大分子进行纯化和制备。
荧光光谱分析法课件
目录 CONTENT
• 荧光光谱分析法概述 • 荧光光谱分析法的基本原理 • 荧光光谱分析法的实验技术 • 荧光光谱分析法的数据处理与分
析 • 荧光光谱分析法的实验案例 • 荧光光谱分析法的展望与未来发
展
01
荧光光谱分析法概述
定义与原理
定义
荧光光谱分析法是一种基于物质吸收 光能后发射荧光特性进行物质成分和 结构分析的方法。
激发态的衰变
电子从激发态返回基态时，以辐射或非辐射方式释放能量，产生荧 光光谱。
荧光光谱的产生机制
荧光光谱是由分子吸收光能后，通过内部转换、振动弛豫和辐射跃 迁等过程产生的。
荧光光谱的组成与特征
荧光光谱的组成
荧光光谱由发射峰、激发峰和斯托克斯位移组成。
荧光光谱的特征
荧光光谱的特征与分子结构、环境因素和激发波长等有关，可用于分析分子的 结构和性质。
荧光光谱的原理及应用ppt课件
58
Rhodamine 101
100
Rhodamine 6G
95
Rhodamine B
31
Tryptophan
13
L-Tyrosine
14
可编辑课件PPT
Conditions for Measurement
PBS PBS Methol 0.1M NaOH, 220C Cyclohexane 0.1 M H2SO4, 220C Ethanol Water
13
荧光波长和强度与结构的关系
①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活
可能性小，荧光强） ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至
猝灭）
荧光光谱的原理及其在分 子自组装中的应用
郑永丽 上海交通大学化学化工学院
20131115
可编辑课件PPT
1
主要内容
概述 荧光光谱法原理 荧光的光谱特性 我们有关荧光的工作
可编辑课件PPT
2
概述
可编辑课件PPT
3
可编辑课件PPT
4
基本概念
能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的， 因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级
温度，溶剂，激发波长，浓度
应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
可编辑课件PPT
18
常用物质的量子产率
Q.Y. Standards
Q.Y. [%]
Cy3
4
荧光光谱的原理与应用课件
03
生物成像技术的融合
荧光光谱技术面临的挑战
荧光背景干 扰 光漂白和光毒性 深层组织成像
荧光光谱技术的未来发展前景
新技术的应用 多模态成像融合
临床应用拓展
CATALOGUE
荧光光谱的实际案例分析
利用荧光光谱研究生物大分子的结构与功能
总结词
详细描述
ห้องสมุดไป่ตู้ 利用荧光光谱检测化学反应的动力学参数
总结词
详细描述
荧光光谱仪器的构造
荧光光谱仪器的应用
荧光光谱仪器在多个领域都有广泛的应用，如生物医学、环境监测、化学分析等。在生物医学领域，荧光光谱可以用来检测 生物组织中的荧光标记物，研究生物分子的结构和功能。在环境监测领域，荧光光谱可以用来检测水体中的污染物。在化学 分析领域，荧光光谱可以用来检测化学物质的成分和浓度。
THANKS
感谢观看
荧光光谱仪器的发展趋势是提高测量精度和稳定性、拓展应用领域和降低成本等。随着技术的不断进步和应用需求的增加， 荧光光谱仪器将会在更多领域发挥重要作用。
CATALOGUE
荧光光谱的应用领域
荧光光谱在生物学中的应用
生物分子相互作用研究 生物标记与成像 生物分子的结构和构象变化
荧光光谱在化学中的应用
利用荧光光谱监测环境污染物的浓度
总结词
详细描述
利用荧光光谱诊断疾病
要点一
总结词
荧光光谱技术可以用于诊断疾病，通过测量生物样本中与 疾病相关的荧光标记物的光谱特征，可以辅助医生进行疾 病诊断和病情评估。
要点二
详细描述
荧光光谱技术利用某些与疾病相关的生物分子在特定条件 下会发出荧光的特性，通过测量这些荧光标记物的光谱特 征，可以辅助医生进行疾病诊断和病情评估。这种技术可 以用于癌症、感染性疾病等疾病的诊断和治疗监测，对于 提高疾病诊断的准确性和及时性具有重要意义。
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2
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0
l1
l 2 l 2
l3
荧光光谱的原理与应用
8
跃迁规则
Franck-Condon原理：
在电子跃迁完成的瞬后原子核的构型没有发生改变、跃迁过程中电子自旋没有 改变、跃迁前后电子的轨道在空间有较大的重叠和轨道的对映性
T1 → S0跃迁）；发射波长为 l3 的磷光； 10-4～100 s 。
电子由 S0 进入 T1 的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转换→系间窜越→振动弛豫→T1
发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间。
荧光光谱的原理与应用
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主要光谱参量
吸收谱
化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线 。
与激发波长无关。
荧光光谱的原理与应用
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斯托克位移
一个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似，但总是较相应
的吸收光谱红移，这称为斯托克位移（Stoke’s shift）。
蒽在溶液中的吸收（虚线）
和发荧射光（光实谱的线原）理光与应谱用
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斯托克位移
产生斯托克位移的主要原因：
➢1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速 率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量， 达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；
激发谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所 呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候又不如吸收谱来的直接。
电子跃迁到不同激发态能级时，
吸收不同波长的能量(如能级
图l2 ,l1)，产生不同吸收带， 但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，
产生波长一定的荧光(如
l’2 )。因此，发射谱的形状
➢2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到 激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；
➢3.发射荧光的激发态多为（π，π*）态，这种激发态较基态时
有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使激
发态的能量进一步降低。
荧光光谱的原理与应用
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反斯托克位移
不过，有时在高温下也可观察到反斯托克位移现象，即荧光光谱移向
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
失活： 激发态 →基态：多种途径和方式(见能级图)；速
度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、T2 … ；
荧光光谱的原理与应用
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雅布隆斯基分子能级图
内转换
振动弛豫 内转换
S
系间窜越
荧光光谱的原理与应用
荧光光谱的原理与应用
主要内容
1
荧光光谱的基本原理
2 荧光光谱仪的原理、操作及数据处理
3
荧光光谱的应用
4
参考资料
荧光光谱的原理与应用
2
荧光光谱的基本原理
荧光光谱的原理与应用
3
荧光定义
荧光是辐射跃迁的一种，是物质从激发态失活到多重性相同的低能 状态时所释放的辐射。
荧光光谱的原理与应用
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱的原理与应用
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无辐射跃迁失活的途径
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间窜越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
吸收光谱的短波方向。这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动 能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致。
既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光。
荧光光谱的原理与应用
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镜像规则
荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影的 关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光谱将 明显不同于该化合物的吸收光谱。
发生了改变的跃迁是允许的；
跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不 重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。
荧光光谱的原理与应用
9
失活的途径
电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过
辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。
失活途径
辐射跃迁
4
基态和激发态
基态： 当一个分子中的所有电子的排布都遵从构造原理
时，此分子被称为处于基态。
激发态：当一个分子中的电子排布不完全遵从构造原理
时，此分子被称为处于激发态。
构造原理：电子在原子或分子中排布所遵循的规则。
➢ 能量最低原理
➢ 泡利不相容原理
➢ 洪特规则
荧光光谱的原理与应用
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电子激发态的多重度
荧光光谱的原理与应用
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辐射跃迁失活的途径
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为 S1 → S0跃迁），发射波长为 l’2的荧光； 10-7～10-9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l’2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（ 多为
激发谱
固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描 出的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线。
发射谱
固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),扫描出 的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线。
荧光光谱的原理与应用
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主要光谱参量
吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。 通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性。
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大。
荧光光谱的原理与应用
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无辐射跃迁失活的途径
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振 动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时 间一般为10-12 s。
内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射 能级跃迁。
电子激发态的多重度：
M = 2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
根据洪特规则(平行自旋比成对自旋稳定)，三重态能级比相应单重态能级
低；大多数有机分子的基态处于单重态；
荧光光谱的原理与应用
6
分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收