第二章基因工程制药新版5

第三节基因工程制药生产的基本过程工具酶的分离纯化 载体的分离纯化 外源DN A 和目的基因的分离和获得 夕卜源DNA 与载体DNA 的切割与连接 宿主细胞的选择和基因导入操作 基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 基因工程菌中试 基因工程菌的扩増和发酵生产 基因工程药物的分离和纯化技术变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例 五、六、七、八六.基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点（_）基因工程菌质粒的不稳定性（二）质粒稳定性的分析方法（三）质粒不稳定的原因（四）提高质粒稳定性的方法（五）基因工程菌的生长速率（六）蛋白质产量/菌体数量比（七）能量供应与菌体生长的关系（八）小分子前体.催化剂供应与菌体生长的关系■因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的w.现象,有分裂不稳定和结构不稳定。

由于质粒不稳定导致的质粒丢失菌与含有质粒的菌之间生产速率不一致导致可能的生长优势,进而能在培养基中逐渐取代含质粒菌成为优势菌群,从而减少基因表达的产率,导致基因工程菌在生产过程中出现不稳定现象。

(二)质粒稳定性的分析方法(1)将工程菌堵养液样品适当稀释,均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基,培养10-12h ,统计所长出的菌落数A ；(2 )然后随机挑选100个菌落,接种到含有抗生素标记的平板堵养基,壇养10・12h , 统计所长出的菌落数B ；(3 )计算B/A的比值。

该比值能反映质粒的稳定性•称为稳定性(stability.ST)不稳定的原因指基因工程菌在分裂的子代菌体中,出现一定比例不含质粒的现象。

它主要与2个因素有关:(1)工程窗产生幺失质粒的概率,拷贝量低的工程细菌,它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。

(2 )丢失质粒的细菌.含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。

2、结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失.或者发生碱基重排.缺失现象,最终导致工程菌性能改变的现象。

（四）提高质粒稳定性的方法1.选择合适的宿主菌厶选择合适的载体3.选择性压力4、分阶段培养5、控制培养条件定化1.选择合适的宿主圉宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。

2.选择合适的载体含低拷贝质粒的菌产生不含质粒的子代菌频率大于含高拷贝质粒的菌。

3.选择性压力因为丢失质粒抗药性筛选法基中不能正常抗药性筛选法的基本操作:生长。

所以可通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。

先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不长的转化子即为重组子挑选' 影印4、分阶段培养工程菌的培养_般分为2个阶段:(1)第_阶段:先使菌体生长至一定密度。

(2 )第二阶段:开始诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因没有表达,减少了丢失质粒的细菌的产生概率,也就増加了工程菌的稳定性。

5.控制培养条件通过温度、pH值、培养基组分■溶解氧的综合调节措施通过以下方法可以提高质粒的稳定性。

(1 )间歇送氧(2 )改变稀释速率6.固定化定化可提高基因重组大肠杆菌的稳定性。

通常用雄题烦征。

比生长速率屮表征微生物生长速率的参数。

菌体生长对于提高质粒的稳定性.减少代 谢副产物的积累.提高外源蛋白质的产量 都有重要的意义。

基因工程菌的生长速率可通过选用不同的碳源.控制补料量、稀释速率的方法来加 以控细菌菌体生长是核酸和蛋白质的综合表现, I 1制。

（六）蛋白质产量7®体数量比, 菌在基因工程菌的发酵蛋白质产量/ Array体数量比基本上是_个恒定值＜细菌生长速度快,其蛋白质合成的速度也相应加快。

Andersen 理论(1)Andersen等人通过实验发现,培养基中所能提供的最大能量决定着工程细菌的最大生长速率。

(2)当培养基提供的能量不足时，细菌往往会产生代谢副产物乙酸，而乙酸则会明显抑制细菌的生长。

其实质是由于三竣酸循环的供能不足,导致部分乙酰辅酶A转化成乙酸来供能。

2、改进方法(1)适当提高pH值,可以减少乙酸的抑制作用。

(2 )分批选用不同的碳源、控制补料速度、能在一定范圉之内,控制细菌的过度生长,从而抑制乙酸的产生。

（八）前体供应与菌体生长的关系1.工程菌的生长速率往往低于未经克隆的原始宿主细胞2.夕卜源基因的大量表达常常引起工程菌的生长停滞。

这种停滞与能量供应无关。

3.在基础培养基中加入氨基酸,能使细菌的生长速率提咼。

4.当合成材料的前体物供应不足时f工程细菌就会产生"严紧反应"当氨酰tRNA不足时,核糖体就会在密码子上停留,并合成ppGpp的魔点蛋白,这是一种调控因子,会导致RNA聚合酶在模板上移动的停顿。

七.基因工程菌中试中试:生物技术药物与其他药物一样，从实验室研究到产业化必须经过中间放大试验的系列工艺研究和验证，这种中间放大试验简称之。

中试放大的目的是验证、复审和完善实验室工艺所研究确定的反应条件，及研究选定的工业化生产设备结构、材质、安装和车间布置等，为正式生产提供数据，以及物质量和消耗等。

■药物从实验室的微量制备到工厂的产业化制备,并不是简单的数量级的线性放大关系,而是各种研究技术的系统集成和放大优化。

■中试研究的理想状况是工艺稳定,工艺规模同等条件放大,使设计的生产批量和成本符合使用要求。

基因工程菌中试需考虑以下几方面:1工程菌的选择2反应器的设计3发酵培养基的组成4工艺最佳化与参数监测控制5计算机应用1工程菌的选择令能用基因重组技术获得祷产潜力护工业原料为壇养基牠产工艺能用一般的工业生产经验』产生和分泌的蛋白质不致病■无毒性、能安全生产。

山弋谢能控制2反应器的设计与化学工程需反应器（发酵令培养细胞系特性夺细胞生长率令发令温度、溶氧.二氧化碳、pH值、代谢产物令后处理效果堪供特殊的营养源■氨基酸、维生素翼供能源,如葡萄糖雀制代谢3堵养基作用:呕供化学元素，如碳、氮、氧、氢、磷.微量元素4工艺最佳化与参数监测控制宀艺最佳化:最快周期、最高产量、最好质量.最低消耗.最大安全、最周全的废物处理效果.最佳化速度与最低失败率的综合指标。

今参数监测控制:☆生物反应中,有4种参数需监测:☆主要参数:pH值.温度、溶氧.二氧化碳☆生物量：浑浊度、细胞组分、总氮量及菌丝干重.脂质☆碳源:糖.有机酸.乙醇.5计算机应用热电耦测量•一温度离子敏感电极…元素氧化还原电极…还原电位热量计…热平衡:却于计wm最终目标：工艺最佳化.产品产量与质量不断提高. 原材料与能源消耗不断下降.成本降低。

经计算机计算f模拟出_个高质、高产、低成本的生产工艺最佳化的控制微生物的数学公式。

八. 基因工程菌的扩增和发酵生产1'（一）基因工程菌培养的程序（三）影响基因工程菌培养的各种因素分析U!（四）基因工程菌的培养设备“一发酵罐I1（五）基因工程菌发酵工艺的优化I1(-) 基因工程菌培养的程序①摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件, 如温度.pH、培养基各种组分以及碳氮比,分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；②培养罐操作：确定培养参数和控制的方案和顺序。

（二基因工程菌的培养方式1.补料分批培养间后■间歇式或连续地补加新鲜培养基,使 菌体进一步生长的方法。

其目的是创造一个覆好的微生物环境,延长菌体的对数生长期,来获得高密度的菌体总量。

,经过一段时将种子接入发酵反应器中,搅拌式培养达到_定的菌体浓度后,同时进行进料.出料操作,通过控制一定的营养物稀释比率,来进行不间断式培养的培养方式。

蠶晦严的恒定'利于控勰蠶工程菌的不稳^'导致连续■影响。

丄1寺骥时间等因素荟景为了维持质粒的稳定性,将固定化技术和基因工程菌结合起来, 养f有利于提咼生产效率。

进行固定化式连续培（三）影响基因工程菌培养的各种因素基因工程菌 含外源重组基因 使外源基因高效表达 产生外源蛋白质传统微生物 不含外源重组基因 使自身基因表达 产生自身的代谢厶接种量的影响5、诱导时机的影响3.温度的影响 6. PH 值的影响培养基的影响 4.溶解氧的影响生物材料目的产物(1)常用碳源:葡萄糖.甘油.甘露糖、果 糖。

(3 )其它组份:无机盐■微量元素.维生素. 生物秦O(4 )无fl 磷在许多初级代谢的酶促反应中是 —个效应因子。

(2 )常用氮源:酵母提取物.蛋白酪蛋 白水解物、玉米浆■硫酸披.硝酸讓■氯化 披。

I 1X 1X 1I1和发酵周期。

(1)接哗小,菌体生长延迟,不利于外源基因的表达。

(2 )腹*中量；占领整个培烝环境,(问陆物霸严适骨于个源基因的表达。

3、遍度的影响温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。

(1)在复制水平,温度可影响基因拷贝数(2 )°在转录水平,温度可影响RNA聚合酶的作用,而来调控基因表达。

(3 )在翻译水平上,还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。

(4 )温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。

谢是有十分重要作用。

细菌在大量扩増 过程中,要进行消耗氧气的生化反应过 程。

因此,维持较高水平的溶解氧水平 (DO2>40%),才能维持工程菌的快 速生长和繁衍。

采用调节搅拌转速的方法,可改善培养过程中的氧供给,提高活菌产量。

溶解氧的影响溶鯉氧对于工程菌发酵过程中的菌体代I 15.诱导时机的影响对于入PL—clts875突变株工程菌来说,在28°C・30°C培养时,突变体能产生阻遏蛋白.来阻止启动子的转译。

当温度升到42C时. 这种阻遏作用就消失。

此时温度对于工程菌的表达起诱导作用。

一般来说,对于处在生长期后期的工程菌进行诱导,如菌体细胞密度在IO?1时, 通过升温诱导,可达到蛋白质表达増产的效果。

pH对于细胞的正常生长.夕卜源蛋白的高效表达都有影响。

(1 )细胞生长期的最佳pH范围是6・8“7・4。

(2 )夕卜源蛋白表达的最佳pH范围是6・0“6・5。

■在发酵过程中,细菌自身对pH值有一定的调节能力。

当pH值超出其调节能力的范围时,会影响细菌生长。

,pH值可控制在7.0 ,随着蛋白质的表■发酵泵,加入碱液。

（四）基因工程菌的培养设备■…发酵罐1'1.发酵罐的组成I1厶发酵罐的要求I1(翩濟謚響趣曙 +溶解氧控制系统。

(2) pH 调节系统…・H 电极+ pH 控制系统+酸 碱补加装置。

綁麟爲麟I 严系(4 )消沫装置(5 )取样装置 (6 )旋转搅拌装置 (7 )进料系统•…培养基加入口。

(谧系统一气体排出+冷却水排出+废2.发酵罐的要求1'(1)总体要求(2 )具体要求(1)总体要求(A)保证发酵环境条件恒定f(B)不影响其遗传特性f(C)不能引起所带质粒丢失。

(A)提供菌体生长的最适条件,(B)培养过程不得污染,(C)保证纯菌培养,(D)培养及消毒过程中不得游离出异物, (E )不能干扰细菌的代谢活动。