《医学微生物学》三大常规的微生物学检查

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查

从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】

正常人的血液是无菌的。当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集

l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。常规血培养抽取5m1分别注入需氧肉汤及厌氧肉汤内；注入厌氧瓶时，应注意将针筒内气泡排尽，再倒转厌氧瓶，将针头插入液体培养基内(针头勿露出液面)，注入血液。

4．采血部位一般为手臂静脉，为提高阳性率，可自感染灶周围静脉采血。亚急性心内膜炎从股动脉采血甚有价值。对末稍血培养阴性的伤寒或布氏菌病患者，可抽取骨髓做培养。

二、血液常见的病原菌

血液标本中常见的病原菌见表10-1

表10-1 血液标本中常见的病原菌

三、血液标本常见病原微生物的分离鉴定 （一）要求

1．了解血液标本的细菌学检验程序（图10-1）。 2．了解脑膜炎奈瑟菌的鉴定要点。

3．了解细菌L 型的培养特点和布氏杆菌的鉴定要点。

图10-1 血液标本的细菌学检验程序

（二）细菌生长后的培养基本变化

已接种的培养瓶，立即置35℃孵育箱内孵育，每日取出观察一次，连续培养7d ，当血培养阳性时，可有数种不同的表现。

增菌培养

一般培养（血平板或

药敏试验

血液（无菌采取）

1.硫酸镁肉汤、胰化酪蛋白大豆肉汤、葡萄糖酚红肉汤(需氧培养）

2.硫乙醇酸盐或牛心脑浸液肉汤（厌氧培养）

5－10d ，如无细菌生长，摇动培养瓶，取一环移种于血琼脂平板，无细菌生长时报告：无细菌生长。若培养布氏杆菌或亚急性心内膜炎

病原菌，应观察一个月始可发

出报告。混浊或沉淀

分离培养需氧培养EMB ）CO2培养（巧克力琼脂平板）

厌氧培养（血琼脂平板）

菌落观察

涂片、染色、镜检纯培养

血清学鉴定生化鉴定发出报告

肉汤均匀混浊并有胶胨者，可能是葡萄球菌；肉汤均匀混浊，发酵葡萄糖产生气泡者，可能是需氧G一杆菌；血层面上出现颗粒状生长，同时溶血者，可能是乙型溶血性链球菌；表面形成较厚的一层膜并溶血者，可能是铜绿假单胞菌；表面形成厚膜，培养液清晰，底层溶血者，可能是枯草芽胞杆菌。

(三）常见病原微生物的鉴定及报告方式

1．脑膜炎奈瑟菌的培养与鉴定：先将翻口橡皮塞加铝盖的培养瓶(含胰胨肉汤或2g／L葡萄糖的肝浸液

，预温至37℃，再将血液标本注入培养瓶、37℃孵育。若用三角烧瓶培养，或肉浸液)内充入5％～10％的CO

2

。孵箱中37℃孵育，每天观察一次。如疑有细菌生长，划线分离于37℃预温的巧应接种后放在5％～10%CO

2

孵箱，37℃孵育18～24h，如出现菌落，鉴定要点如下：

克力色平板或血平板，置5％～10%CO

2

(1)菌落特征：光滑、湿润，透明，粘性，中等大小的菌落，露滴样，菌落易乳化，在生理盐水中不自溶，不产生色素。

(2)涂片镜检：革兰氏阴性双球菌。

(3)生化反应：氧化酶试验(+)；分解葡萄糖，麦芽糖，产少量酸。

(4)血清玻片凝集试验：先用接种环分别挑取多价I，Ⅱ，Ⅲ多价诊断血清，滴于洁净的玻片上。另取生理盐水与正常血清各一杯，置玻片上做对照。挑起少量菌苔，分别与多价血清、生理盐水、正常血清混合，将玻片上下摇动，阳性者在1～3min内出现凝集(++)，对照不凝集。再分别与单价血清作凝集试验以确定型。

报告方式：符合以上四项者，可报告“检出脑膜炎奈瑟菌”。

2．布氏杆菌的培养：将疑似布氏杆菌感染的血标本分别接种2支肝浸液，置10％C0

孵箱和普通孵箱37℃

2

孵育，每天观察一次，每5d移种一次血平板。培养一周后，若肝浸液中出现肉眼可见的轻度混浊，久之出现

和普通培养，继续菌膜并有粘稠的沉淀物时，涂片染色镜检，并立即移种于2份肝浸液平板或血平板、做CO

2

观察培养结果。

(1)形态及染色：布氏杆菌呈G－球杆菌，两端钝圆，偶见两极浓染。用柯兹洛夫斯基染色法(用5g／L的沙黄微加温染色2min，水洗，再用5％的孔雀绿染1min，水洗、干后镜检)，布氏杆菌染成红色，其他细菌染成绿色。

(2)固体培养基上生长特点：经2～3d培养出现菌落，4～5d菌落直径2～3mm，无色、半透明、圆形、表面光滑、边缘整齐，中央稍凸起，可出现粘液样或干燥的硬样菌落。血平板上不溶血。

细菌培养如30d后仍无细菌生长，则可报告“经X周培养，无细菌生长”。如有菌生长，则根据细菌的菌落特点，镜检的形态和染色性等作初步诊断，最后作血清凝集试验，试验菌出现凝集者可以报告：“培养出布氏杆菌。”

3.细菌L型的培养：

（1）培养基：高盐培养基，高渗糖培养基和细菌L型平板。

（2）检查方法：

1)血液、骨髓标本直接接种高盐和高渗糖培养基，37℃增菌培养后转种血平板和L型半板，37℃孵育后观察结果。

2)对已接种一般液体增菌培养基的血液和骨髓标本，经37℃培养后，如培养基混浊不明显，并转种血平