淋球菌临床菌株的收集流程图

淋球菌临床菌株的收集流程图淋球菌临床菌株的收集SOP1、标本的采集、接收与处理1.1标本采集的基本要求1.1.1应使用正规的检查方法和试剂，取材方法要简便，不需要使用特殊的仪器。

1.1.2取标本以不损伤病人为好，尽量使用非侵入性采集方法。

1.1.3所用的器材对病原体的活力无影响或影响很小。

1.1.4操作应规范化。

如取材后需要做细菌培养，应尽快接种。

1.1.5应由医务人员亲自采集标本，一般不应由病人自取。

1.1.6所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作。

1.2淋球菌培养的标本取材1.2.1男性患者：将男性采样拭子深入到尿道内2—4cm处，轻轻转动并停留10—15秒钟后取出，取出的分泌物带有黏膜细胞。

1.2.2女性患者：从女性患者的宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器（不可用液体石蜡等润滑油），然后将女性采样拭子插入宫颈管1-1.5cm处，轻轻转动并停留20—30秒取出。

为了提高阳性率，可同时取两份标本进行培养。

1.3标本接收的标准1.3.1标本登记：登记内容详见淋球菌菌株来源登记表。

1.3.2 对不合要求的标本，可以拒绝接收。

2、淋球菌的实验室检测2.1分泌物涂片显微镜检查2.1.1原理淋病感染者的泌尿生殖道常见有黄色脓性分泌物，取分泌物作涂片，经过革兰染色后，在显微镜下可见在多形核白细胞内或周围紧相连处有红色的呈双肾形排列的双球菌。

2.1.2方法1)涂片：将拭子在载玻片上轻轻滚动涂片。

2)固定：待涂片在室温中自然干燥，涂片经火焰固定。

3)革兰染色：（BASO珠海贝索快速革兰氏染色液）①第一液（龙胆紫液）：染10秒，水洗甩干。

②第二液（碘溶液）：染10秒，水洗甩干。

③第三液（脱色液）：脱色10-20秒，水洗甩干。

④第四液（沙黄溶液）：复染10秒，水洗甩干。

4)镜检：晾干后的载玻片滴加香柏油，先在低倍镜下找到视野后转换到油镜观察结果。

2.1.3结果2.3.1.1结果判读：淋球菌为革兰氏阴性菌，经革兰染色后呈红色，肾形，常呈双排列，两菌接触面扁平或稍凹。

菌体长约0.7um,宽约0.5um。

2.3.1.2结果报告：根据镜检的“多形核白细胞内找到革兰阴性双球菌”、“多形核白细胞外找到革兰阴性双球菌”和“未找到革兰阴性双球菌”三种结果做出相应的报告。

2.1.4临床意义1)取自男性急性淋球菌性尿道炎患者的标本，检测敏感性及特异性高达95%，作为临床诊断的依据。

2)不推荐用涂片法对女性感染者，亚临床感染和疗效检测者以及取自直肠和咽喉等其他部位的标本进行判断。

3)如果在多形核细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。

4)从患者采集的标本，涂片革兰染色结果阳性，不可直接报告“找到淋球菌”2.1.5注意事项1)应根据感染者的性行为方式、病史、临床表现和检测目的，合理的选择采集标本部位。

2)涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭子在玻片上轻轻滚动。

涂擦过度或来回涂擦，会使细胞膜破裂或变形，淋球菌从胞内溢出来。

3)涂片厚薄要适宜，脱色时间要根据涂片厚薄做适当调整。

4)革兰染色试剂：BASO珠海贝索快速革兰氏染色液，试剂要做定期的质量检查。

5)找到“革兰阴性双球菌”后按照检测操作规程，根据需要作分离培养及生化鉴定。

6)单纯在细胞外查到革兰阴性双球菌不能定为淋球菌，应作培养鉴定。

诊断淋病一定要遵守细胞内查到革兰阴性双球菌的原则。

2.2淋球菌的分离培养2.2.1原理淋球菌可以在营养丰富的培养基上及合适的环境下培养，并且生长成有一定特征的菌落。

淋球菌培养法是诊断淋病的主要依据，分离的单个菌落经纯培养后，可以进一步进行鉴定。

2.2.2方法2.2.2.1 培养（也可购买成品淋病奈瑟氏菌培养基）2.2.2.1.1T-M培养基的配制(1)准备：成分：1)GC基础粉：36g/L2)血红蛋白粉：20g/L3)VCN抑菌剂：每L添加2瓶4)VITOX添加剂; 每L添加2瓶器皿：1)三角烧瓶（1L、500ml各一个）：清洗并晾干2)水浴箱：调至50℃备用3)分析天平:开机预热30分钟4)生物安全柜：紫外线消毒30分钟5)加热磁珠搅拌器6)无菌平皿(2)配制：1)制备双倍浓度的基础培养基：将GC基础粉36g溶于488ml蒸馏水中（用1L烧瓶），充分混匀，边加热，边搅动，直至煮沸1分钟，使其完全溶解。

2)将20 g血红蛋白粉加到100ml蒸馏水中研成糊状，再逐步加入蒸馏水至488ml制成溶液。

3)将上述二液分别121℃高压灭菌15分钟，冷却到50℃左右备用。

4)配制VCN抑菌剂：每安瓿抑菌液以无菌手续加入蒸馏水2ml，摇动，使充分溶解。

5)配制VITOX增菌剂：每安瓿增菌剂以无菌手续加入所附的稀释液10ml，摇动，使充分溶解。

6)以无菌手续将GC培养基488ml、血红蛋白溶液488ml、增菌剂20ml和抑菌剂4ml混合倾注平皿至4℃储存备用。

2.2.2.1.2培养条件1)温度：淋球菌培养的最适温度为35-36℃，超过38.5℃或低于30℃便生长不良，因此，孵育的温度要恒定。

2)淋球菌为需氧菌，繁殖需要5-10%CO2环境，也可用CO2培养箱。

3)湿度：为保持一定的湿度，可在培养缸内放些浸水棉球。

2.2.2.1.3选择培养标本取材后应尽快接种于预温的TM培养基上，将拭子紧贴在培养基表面滚动涂布约四分之一培养皿；然后用接种环分区划线，以便在培养后获得单个菌落。

标本接种后，立即置于35-36℃、5-10%CO2、湿度＞70%的CO2培养箱中培养。

2.2.2.1.4纯培养挑取单个可疑菌落，转接种到TM培养基中，置35-36℃、5-10%CO2培养24-48小时，以获得纯菌。

2.2.2.2淋球菌的初步鉴定—氧化酶试验2.2.2.2.1方法：0.5-1%盐酸四甲基对苯二胺（或盐酸二甲基对苯二胺）滴加在含有疑似菌落的滤纸上。

2.2.2.2.2结果：深紫蓝色（盐酸四甲基对苯二胺）或深紫红色（盐酸二甲基对苯二胺）的为氧化酶试验阳性，颜色改变很快并且保持30秒以上。

2.2.2.2.3注意事项：1)氧化酶试验阴性可排除淋球菌，但阳性不能判为淋球菌，因某些细菌的氧化酶试验亦呈现阳性。

2)氧化酶试剂不应过分陈旧，正常的试剂应为淡红色。

试剂配好后放在棕色玻璃瓶中于4℃冰箱中避光保存，可使用一周。

3)氧化酶试剂遇铁会产生红色反应而造成假阳性，所以，操作用的接种环应避免用铁丝或电炉丝等制成，选择用镍铬丝、白金丝或一次性接种环为好。

2.2.2.3淋球菌的确证/鉴定—糖发酵试验2.2.2.3.1方法：1)取杭州天和微生物试剂有限公司的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖细菌微量生化反应管用砂轮打开。

2)用取菌针挑取纯培养的淋球菌菌落，接种到各糖发酵管中，充分混匀。

3)37℃孵育2-4小时后观察结果。

2.2.2.3.2结果：淋球菌只发酵葡萄糖，不发酵其他糖，产酸不产气。

如葡萄糖管由原来的红色变成黄色，其他糖管颜色不变，为阳性。

2.2.2.3.3注意事项：1)试验所用糖纯度要高，应选用分析纯以上的糖。

2)待检菌株应使用应使用16-18小时的纯培养细菌。

2.2.2.4涂片单个可疑菌落制成的涂片经革兰染色后，可见约25%的菌为典型双球菌，其他75%为单球菌、四联型或八叠型。

2.2.3结果2.2.3.1结果判读：结果判读的依据为根据培养24-48小时后的菌落特征、革兰染色镜检形态、氧化酶反应及糖发酵试验等对菌株进行鉴定的结果。

2.2.3.2结果报告：经24～48小时培养，具有典型的淋球菌菌落特征（菌落为圆形、凸起、湿润、光滑、呈水珠样半透明或灰白色菌落，边缘呈花瓣状，直径0.5-1.0mm），革兰染色阴性及氧化酶试验阳性可报告为“初步鉴定有淋球菌生长”，如有糖发酵试验结果可以报告“确证培养有淋球菌生长”；培养48小时仍无淋病奈瑟菌特征菌落生长可报告”无淋球菌生长”。

2.2.4临床意义培养法有较高的敏感性和特异性，是世界卫生组织推荐的诊断淋病的“金标准”。

对女性和亚临床感染者以及疗效观察者的检测标本都有较高的敏感性。

2.2.5注意事项1)极其少量的消毒剂、防腐剂和润滑剂会影响培养阳性率。

2)淋病奈瑟菌对干燥和温度特别敏感，为了保证标本培养的阳性率，取材后应将标本接种于预温后的TM选择性培养基并尽快送到实验室。

不能及时转送的接种培养基应注意保温。

3)对于未严格按无菌操作采集的标本，标本在低温下保存超过2小时，标示不明、容器破损等的标本，实验室应予拒收。

4)观察菌落形态最好在36小时左右，小于24小时的菌落太小难以辨认，大于48小时的菌落特征会有较大改变可能误判。

3菌株保存3.1琼脂保存：淋球菌在巧克力琼脂上保存，需每天传代3．2牛奶管保存：将培养物洗于脱脂牛奶中，-25摄氏度冰箱可保存2个月，-70摄氏度冰箱可保存1年3.2.1牛奶管制备：a)前期准备：高压消毒大枪头；清洗250ml的量筒一个、500ml三角烧瓶一个、玻棒一根。

晾干备用。

b)称量：预热电子天平30分钟，去皮称量OXOID奶粉20g。

c)配制：将20g奶粉放入500ml三角烧瓶内，加少量蒸馏水，使用玻棒进行搅拌，直至奶粉充分溶解。

将溶解后的奶粉放入250ml量筒，加蒸馏水至200ml。

d)灭菌：将配制好的牛奶放入高压蒸汽灭菌器中进行灭菌消毒，121℃灭菌5分钟。

e)分装：将牛奶分装至灭菌冻存管中，每管500μl。

f)保存：-70℃保存。

(2)牛奶管质量控制：将配制的牛奶管进行无菌试验，利用无菌环取适量的牛奶接种于血平板上，37℃培养24-48h。

未长菌方可使用。

(3)牛奶管菌种保存：取纯培养24小时的新鲜淋球菌菌落，将培养物接种于牛奶管中（菌量不易太多；分管保存，每管500μl），然后冻存于-20℃（可保存2月）或-70℃冰箱保存备用（可保存1年）。

3．2.2注意事项：牛奶管冻存后，需保持低温，若溶解后反复冻融，菌株死亡率高。