双水相萃取影响因素
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取原理
双水相萃取原理双水相萃取是一种常用的分离和提取技术，广泛应用于化工、生物制药、环境保护等领域。
它是利用两种不相溶的溶剂（通常是水和有机溶剂）之间的相互作用，将目标物质从一种相中转移到另一种相中的过程。
在这个过程中，萃取剂的选择、相互作用机理、萃取条件等因素都对萃取效果有着重要的影响。
首先，我们来谈谈双水相萃取的基本原理。
在双水相系统中，两种相的界面上存在着大量的界面活性剂，这些界面活性剂能够形成胶束结构，使得两种相之间形成了一定的亲和力。
当目标物质存在于其中一种相中时，由于界面活性剂的存在，目标物质会在两种相的界面上分配，从而实现了目标物质的转移和分离。
其次，双水相萃取的原理还涉及到了萃取剂的选择。
通常情况下，我们会选择一种水相和一种有机相作为双水相系统的溶剂。
这两种溶剂的选择应该考虑到目标物质的亲和性，以及两种相之间的亲和性。
另外，萃取剂的选择还应该考虑到工艺操作的便捷性、回收利用的可行性等因素。
另外，双水相萃取的原理还受到了萃取条件的影响。
萃取条件包括温度、pH 值、搅拌速度等因素，这些条件会直接影响到目标物质在两种相中的分配情况。
通过合理地控制萃取条件，我们可以实现目标物质的高效分离和提取。
最后，双水相萃取的原理还涉及到了相互作用机理。
在双水相系统中，两种相之间的相互作用是通过界面活性剂来实现的。
界面活性剂的存在使得两种相之间形成了一定的亲和力，从而实现了目标物质的转移和分离。
同时，界面活性剂的种类和用量也会直接影响到双水相萃取的效果。
综上所述，双水相萃取是一种重要的分离和提取技术，其原理涉及到了萃取剂的选择、萃取条件的控制、相互作用机理等多个方面。
通过对这些因素的合理把握，我们可以实现对目标物质的高效分离和提取，为化工、生物制药、环境保护等领域的生产实践提供了重要的技术支持。
希望通过本文的介绍，读者能够对双水相萃取的原理有一个更加深入的了解。
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
双水相萃取
介绍你所知道的新型分离技术。
双水相萃取：双水相萃取是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一的浓度下, 体系就会自然分成互不相容的两相。
被分离物质进入双水相体系后由于表面性质电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响, 在两相间的分配系数K 同, 导致其在上下相的浓度不同, 达到分离目的。
现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景，将有力推动生物技术的发展。
利用聚乙二醇( PEG ) /磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶, 确定最佳体系是22% PEG6000, 10% K2HPO4和12% NaCl活性酶的产率可达98% 。
除此以外,在近几年的报道中双水相萃取已用于多种蛋白质和生物酶的分离, 如牛血清蛋白( BSA )、牛酪蛋白、β- 乳球蛋白、血清蛋白; α- 淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶( PGK )和磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH )、葡糖淀粉酶、L- 天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离。
β- 内酰胺类包括青霉素和头孢菌素, 是应用广泛的抗生素药物; 大环内酯类抗生素如:红霉素和乙酰螺旋霉素都利用ATPE 技术得到了较好的收率; 在多肽类抗生素中,用双水相体系对万古霉素的提取也得到了满意的结果。
双水相萃取技术的特点ATPE 作为一种新型的分离技术, 对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势:(1)含水量高( 70% -90% ), 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性;(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质, 还能不经过破碎直接提取细胞内酶, 省略了破碎或过滤等步骤;(3)分相时间短, 自然分相时间一般为5 m in -15 m in;(4) 界面张力小( 10- 7 -10- 4mN /m) , 有助于两相之间的质量传递, 界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;(5)不存在有机溶剂残留问题, 高聚物一般是不挥发物质, 对人体无害;(6)大量杂质可与固体物质一同除去;(7)易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊理;(8)操作条件温和, 整个操作过程在常温常压下进行;(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
双水相萃取全解
1、双水相体系的组成
双水相体系的主要成因——聚合物的 不相溶性
双水相现象是当两种聚合物或一种聚 合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合 物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍 作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐 浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两 相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水 相。
① 聚合物∕聚合物双水相
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
双水相萃取全解
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作 三、影响双水相的因素 四、双水相萃取的应用 五、双水相萃取技术的发展
前言
• 双水相萃取现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。
但一般来说，当双水相系统离双节线足够远 时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影 响目标产物的萃取分离。
大规模双水相萃取操作一般在室温下进行， 不需冷却。这是基于以下原因：
(l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相 (2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶质 如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般不 会发生失活、变性。 (3)常温操作节省冷却费用。
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
双水相萃取
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
5.3 双水相萃取
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
8
盐类的影响
7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.1 0.2 ×Ë Á á ¼ Ø £ ¨ 0.3
µ KÖ
盐浓度对K值的影响
○普鲁兰酶，9%PEG4000 /1.25%DexT500 ,pH7.8 □富马酸脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ●甲醛脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ▣1,4-葡萄糖磷酸化酶，7.2%PEG4000 /6.7%DexT500 , pH7.5
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
聚合物分 子量的影响
1.9
ý K µ Ê ä Ï ·Å Ö
1.4 0.9 0.4 0 0.5 1 1.5 2
Ͼ Æ ÛÌ Ç· Ö× ÓÁ ¿× 100000
葡聚糖平均分子量对酶的分配系数的影响
■ 异亮氨酰基-tRNA 合成酶，9.3%PEG/6.2%Dex,73mM 磷酸钾，pH7.0 ▤ α -糖苷酶，10%PEG/5%Dex,100mM 磷酸钾，pH6.3
• 酶的双水相萃取可以在室温下进行.
• 使用 PEG/(NH4)2SO4 相系统从细菌中萃取荧光素酶时， 温度对分配系数的影响不明显。
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
双水相体系的性质
• 黏度：
• 两相密度差：
• 表面张力：
不仅影响相分离速度 和流动特性，而且影 主要决定于体系的组成 响物质的传递和颗粒 和两相间组成的差别， 在两相中的分配； 在相图上体现在与结线 的长度成线性关系； 一般加入不同比例 的磷酸盐和氯化钠 来控制相间电势
1）定义： •将对目的酶具有离子交换、疏水作用或适当亲和力的亲和
双水相萃取
3.影响物质分配的因素
大规模操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于： (a) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质不会 发生变性；
(b) 常温下溶液粘度较低，容易相分离；
(c) 常温操作节省冷却费用。
3.影响物质分配的因素
3.5 生物分子疏水基团的影响
• 对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的 比例以及胞内蛋白质在体系的分配系数。 • 这种分配的差异主要是由细胞破碎程度引起的，细胞壁 和细胞膜不同的化学结构也会导致体系上下相比例的改 变。 • 此外，因为PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，细胞物 质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。所以PEG的存 在改变了物质的溶解曲线。
利用中空纤维膜传质面积大的特点,将膜分离与双水相 萃取相结合,可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相 体系隔开,可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面 的吸附问题。因此,将膜分离同双水相萃取技术相结合,是 解决双水相体系易乳水相萃取技术的进展
5.2.2 双水相萃取同亲和层析相结合—亲和双水相
1.双水相体系概述
1.1 双水相萃取的原理 Sub Text title1
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似， 都 是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质 不同，物质进入双水相体系后，由于分子间的范德华力 、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作 用，目标物质在上、下相中的浓度不同，从而达到分离 的目的。
3.2 pH的影响
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： 第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性质和数量。
第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改变H2PO4-和 HPO42- 之间的比例，进而影响相间电位差。这样蛋白质 的分配因pH值的变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋 白质的分配系数改变2～3个数量级。
双水相萃取的原理及应用
双水相萃取的应用
ATPE 的应用
双水相萃取的应用 3) 核酸的分离纯化
ATPE 的应用
4) 病毒、细胞器、细胞的分离
ATPE 的应用
4) 病毒、细胞器、细胞的分离
ATPE 的应用
双水相萃取的应用 5）中草药成分的提取
甘草、银杏液、黄芩苷等的有效成分分离。 谢涛等利用 PEG 4000/ K2HPO4 组成的双水相体 系从三七中萃取三七皂苷,回收率为 96 %。
(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋 白质（或酶），可直接提取细胞内酶，避免破碎或过滤等 步骤。
ATPE 的特点
双水相的特点
(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min。 (4)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)，利于两相之间的质量 传递。
(5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物不易挥发， 对人体无害。
ATPE 的历史：
ATPE 的历史：
双水相萃取可分离多肽、蛋 白质、酶、核酸、病毒、细胞、 细胞器、细胞组织，以及重金 属离子等，近年来，还应用于 一些小分子，如抗生素、氨基 酸和植物的有效成分等的分离 纯化。作为反应系统用于酶反 应，生物转化，发酵的产物生 产与分离的集成。
ATPE 的历史：
ATPE 的基本原理:
双水相萃取的原理及应用
双水相萃取
萃取温度
• 在临界点附近尤为明显。但当远离临 界点时，温度影响较小。 • 大规模生产常在常温操作，但较高升 温还是有利于降低体系黏度，利于分 相。
无机盐浓度
• 盐的正、负离子在两相间分配系数不同， 两相间形成电位差，从而影响带电生物大 分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两 相间的电位差。
双水相萃取法在天然产物纯化中的 应用
双水相的种类
常见的能形成双水相体系的高聚物有聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇、甲基聚乙二醇、聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素 、葡聚糖、聚丙基葡聚糖、羟丙基葡聚糖、聚蔗 糖, 无机盐有硫酸钾、硫酸铵、草酸钠、磷酸钾等 。
双水相萃取特点
① 两相的溶剂都是水 ,上相和下相的含水量 高达70%～90% ,不存在有机溶剂残留问 题 。 ② 常温常压操作 ,不会引起生物活性物质失 活或变性。 ③ 两相界面张力小,萃取时两相能够高度分 散 ,传质速度快。 ④ 溶剂对目标组分选择性强,大量杂质能与 所有固体物质一同除去 ,使分离过程简 化 ,易于工业放大和连续操作。
1.2 新型双水相萃取系统
传统双水相系统主要使用黏稠的水溶性高聚 物,后处理比较烦琐,目前乙醇、丙酮等与水互溶 的有机溶剂也被引入到双水相系统中。乙醇、丙 酮等有机溶剂具有价廉、低毒、易挥发、易回收 等特点,与高分子聚合物相比有较强的工业化优 势。采用传统工艺对中药成分进行提取和纯化存 在收率和纯度较低、工艺复杂、多种有机溶剂残 留等问题,因此利用温和的双水相系统对中草药 有效成分的提取进行研究是很有意义的工作。
双水相萃取的原理
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一 种盐溶于同一溶剂时, 由于聚合物之间或聚合物 与盐之间的分子空间阻碍作用 ,无法相互渗透 , 当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不 互溶的两相 ,因为使用的溶剂是水 ,所以称为双 水相。 当物质进入双水相体系后 ,由于表面性质、电 荷作用和各种力 如憎水键、氢键和离子键等 的 作用和溶液环境的影响,使其在上、下相中的浓度 不同,即各成分在两相间的选择性分配 的纯化
双水相萃取技术
三、双水相体系的组成
• 当两种高聚物的水溶液相互混合时，若两种 被混合分子间存在空间排斥作用，使它们之间无 法相互渗透，则在达到平衡时就有可能分成两相， 形成双水相。两相的组成和密度均不相同，通常 密度较小的一相浮于上方，称为上相（轻相）； 密度较大的一相沉于下方，称为下相（重相）。 一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所 差异，混合时就可以发生相分离，并且差别越大， 相分离倾向就越大。 • 聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐是常用 的双水相体系，由于葡聚糖价格昂贵，因此聚乙 二醇/无机盐体系应用更为广泛。聚乙二醇/无机 盐中所用无机盐主要是磷酸盐和硫酸盐。
参考文献
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3、无机盐的循环
将盐相冷却，结晶，然后用离心机离心 分离回收。其它方法有电渗析法、膜分离 法回收盐类或除去PEG 相的盐。
五、影响双水相萃取技术的因素
• • • • • •
组成双水相系统的高聚物类型 高聚物的平均分子量及浓度 组成双水相系统的盐的种类 离子强度和浓度 被分离的各种物质的种类、性质、分配特性等 操作条件如pH值、温度等
四、双水相萃取技术的工艺流程
双水相萃取技术的工艺过程主要由3 部分构成：目的产物的萃取、PEG 的循 环、无机盐的循环。
超临界液体萃取和双水相萃取
等温法 等温法是超临界流体萃取常用的一种流程，它通过 改变压力使萃取组分从超临界流体中分离出来。 含有萃取质的超临界流体经过膨胀阀后压力下降,其 萃取质的溶解度下降。溶质析出由分离槽底部取出, 充当萃取剂的气体则经压缩机送回萃取糟循环使用。
等压法
等压法是利用温度的变化来实现溶质与萃取剂的分 离。 含萃取质的超临界流体经加热升温后，超临界流体
双水相系统的类型
双水相系统分为两大类： 1）高聚物／高聚物
如：PEG/Dx,聚丙二醇/PEG,甲基纤维素/DX
2）高聚物／低分子
如：PEG/磷酸钾, PEG /磷酸铵, PEG/硫酸钠
PEG/磷酸钾系统的典型相图
图中的曲线称为双结线 该双结点线把整个图面
Байду номын сангаас
分成两个区域:双节线以
下的区域为均相区,以上 的区域为两相区。 结线：连接平衡两相组 成的直线。
超临界萃取剂
表 4-3 常见超临界流体的物理性质 化合物 CO2 氨 甲醇 乙醇 异丙醇 丙烷 正丁烷 正戊烷 苯 乙醚 蒸发潜热 (25℃) KJ/mol 25.25 23.27 35.32 38.95 40.06 15.1 22.5 27.98 33.9 26.02 沸点 (℃ ) -78.5 -33.4 64.7 78.4 82.5 -44.5 0.05 36.3 80.1 34.6 Tc,℃ 31.3 132.3 240.5 243.4 235.5 96.8 152.0 196.6 288.9 193.6 临界参数 pc, MPa 7.15 11.27 8.1 6.2 4.6 4.12 3.68 3.27 4.89 3.56 dc g/cm 0.448 0.24 0.272 0.276 0.273 0.22 0.228 0.232 0.302 0.267
双水相萃取专业知识
两相物性旳差别，使双水相萃取具有本身旳特征。
特征：
操作条件温和 表面张力大大低于有机溶剂相与水相间旳表面张力； 两相分散旳耗能低，分散程度高，传质面积大，传质速率快； 在温和旳萃取条件下，到达较高旳萃取效率。
安全性能高 药物生产，双水相萃取质量和安全性好； 高聚物一般为不易挥发物质，操作环境对人体无害。
这种易于放大旳优点对于新药研制 中生产工艺旳开发极为有利
双水相萃取技术旳进展
用变性淀粉PPT替代昂贵旳Dextran。PPT-PEG体系 已被用于从发酵液中分离过氧化氢、β-半乳糖甘 酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEGDextran体系相图非常相同，并具有下列优点：
伴随生物技术旳发展,必将增进双水 相萃取体系旳完善,从而更显示出双水 相体系萃取分离技术在生物物质分离 中旳独特优点.
在双水相系统中旳被分离物传质速度快，因而到达 分配旳时间短，但因两相密度相差小，分配困难， 是其主要矛盾。
利用离心沉淀可加紧相分离速度
体系旳选择和优化
1）、体系选择旳原则： 根据目旳pro和共存杂质旳HFS\M\pI\Z等旳差别, 综合利用静电、 疏水和添加合适种类和浓度旳盐，可选择性萃取目旳产物。
双水相旳类型： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵
当两种高聚物水溶液混合物混合后旳总构成点 落在两相区（如：点M）可形成互不相溶旳两 相T和B。两相旳构成和密度均不同。一般，T 相为上层，高聚物PEG含量较高；B相为下层， 高聚物KPI含量较高。
双水萃相取旳理论基础
表面电荷
当盐旳正、负离子对上下相有不同旳亲和力，即 正负离子旳分配系数不同步，就会产生电位。
第七节 双水相萃取法总结
（二）分配系数 影响分配系数的因素包括很多，如粒子大小、 疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等， 这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变 化，因而双水相萃取有较好的选择性。
三、影响双水相萃取的因素
（一）、成相高聚物的分子量
一般原则:对于给定的相系统，如果一种高聚物被低分子量的同种高 聚物所代替，被萃取的大分子物质,如蛋白质、核酸、细胞粒子等，将 有利于在低分子量高聚物一侧分配.
四、影响因素
1、 表面活性剂的种类：早期用一种表面活性剂,现在混合体系的研究较多
2、水相pH值：决定蛋白质表面带电基团的离子化状态,与表面活性剂的头 部基团有相互作用 3、温度：提高温度可使反胶束排斥水,起浓缩作用 4、离子强度：降低带电蛋白与反胶束极性基团的相互作用,并导致高离子 强度下反胶束颗粒变小 5、亲和反胶束萃取：导入亲合配基,提高萃取率和选择性
α-淀粉酶和蛋白酶 用 PEG/(NH4)2SO4 双水相体系 , 经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜 条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)pH=8.
红霉素的提取
系统分别为AKM(马来酸酐和环氧乙烷共聚物)/磷酸盐,PEG/磷酸盐和 PEG/葡聚糖,考察了pH和添加中性盐的影响。当pH>6时,AKM/磷酸盐 对红霉素的分配更为有效,当添加中性盐(NaCl、Na2SO4)时,红霉素的 分配系数迅速增大.
双水相萃取技术(two-aqueous phaseextraction) : 利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系 统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在 互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法， 称为双水相萃取法。
双水相萃取
（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）
聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。
对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。
这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：
成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：
盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水
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双水相萃取影响因素
双水相萃取（SDME）是一种新型、高效的样品前处理技术，可用于化学分析和生物分
析等领域，尤其是在食品、环境和药物分析中应用广泛。
本文从理论和实际应用的角度，
分析了双水相萃取的影响因素，以期为相关领域的研究和应用提供参考。
一、原理和机理
SDME的原理是利用不同极性的两种液体（称为萃取相和反萃取相），通过界面活性剂的作用，形成两个不相溶的液相，样品分子在两个液相之间分配。
通常情况下，萃取相为
有机相，反萃取相为水相，通过萃取相与水相之间的互相渗透和传递，达到从样品中提取
目标化合物的目的。
具体实现过程如下：
1. 在反应器基底加入水相；
2. 加入萃取相和表面活性剂，搅拌混合数分钟，形成两相；
3. 将要分析的溶液加入反应器中，搅拌混合数分钟；
4. 将萃取相吸取至分析管中分析。
根据分析需要，萃取相和反萃取相的性质可根据实际情况选择。
例如：反萃取相可以
是水，也可以是其他非极性的有机溶剂（如正己烷）；萃取相可以是极性的醇类（如乙醇、异丙醇等）或非极性的烃类（如十二烷、环己烷等）。
表面活性剂通常选择SDS、Tween-80、CTAB等。
二、影响因素
1. 萃取相和反萃取相的性质
萃取相和反萃取相的性质包括极性、表面张力和相容性等，是影响SDME效果的关键因素。
通常情况下，萃取相为有机相，反萃取相为水相，且两种相应具有较好的互相溶解性。
萃取相的极性越大，提取的目标化合物就越多。
同时，需要注意的是，萃取相和反萃取相
之间的相容性不能太强，否则会影响其形成两相的能力。
2. 表面活性剂的种类和浓度
表面活性剂的种类和浓度是影响SDME效果的另一个重要因素。
表面活性剂的作用是促进萃取相与反萃取相的形成，同时还可以增加两相之间的交互面积，从而提高样品分子在
两个液相间的分配速度和效率。
SDS、Tween-80和CTAB等表面活性剂均可应用，不同表面活性剂对于不同种类的目标化合物具有不同的选择性。
同时，表面活性剂的浓度也会影响SDME的效果，浓度过大，会形成胶体，浓度过低，会影响SDME两相的形成。
3. 混合液的搅拌速度和时间
混合液的搅拌速度和时间是影响SDME效果的重要因素。
搅拌速度过快，会让混合液形成乳液，影响SDME的效率。
搅拌时间过短，则无法充分使目标化合物在两个相中分配。
一般来说，合适的搅拌速度和时间可以有效地促进两相之间的均匀混合和化学反应。
4. 目标化合物的性质
目标化合物的性质对SDME效果也有着较大的影响。
例如在高pH条件下，一些硫代硫
酸盐化合物的溶解度较低，在SDME过程中难以被抽取。
因此，在设计SDME实验时，需要
根据分析目的，结合目标化合物的性质，选择合适的反萃取相和萃取相。
5. 样品的性质
样品的浓度和溶解度、样品的复杂程度和pH值等，也是影响SDME的因素。
例如，在
样品复杂的情况下，必须选择合适的提取方法，以保证目标化合物提取效果。
此外，SDME
过程中目标化合物的浓度也应根据测试目的进行适当调整。
三、应用实例
SDME已广泛用于各个领域，例如环境和食品领域的农药残留分析、药物代谢产物和生物标志物的提取、天然产物和化合物的制备等。
以下以药物代谢产物为例，介绍SDME的应用实例。
1.物质及试剂
头孢他啶酯（CET）标准品(CET; purity≥ 99.5%)，乙醇，n-十二烷（analytical grade），十二烷基三甲基氯化铵（CTAC）（analytical grade）, 硫酸氢钠（analytical grade），无水硫酸钠（analytical grade）。
2.方法
选用CET及其代谢产物作为实验分析的目标物质。
在实验过程中，取一定量的n-十二烷和CTAC，与一定量的900 mmol/L的NaCl溶液脱水乙醇混合均匀，搅拌，形成一个有机相和水相。
将萃取相吸到试管中，加入一定量的无机盐和乙酸溶液，过滤吸取液，制备分
析样品。
3.结果
通过对头孢他啶酯代谢产物的分析，证明SDME能够有效地提取头孢他啶酯的代谢产物。
总之，SDME是一种高效、易于操作的样品前处理技术，具有高灵敏度、高选择性和高通量等优点，因此受到广泛的关注和应用。
通过对SDME的影响因素的探究和实践应用的总结，可以为相关领域的研究和应用提供参考。