饲料酶活性测定方法
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力-文档资料
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力1 引言葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。
电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。
傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。
缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。
因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。
反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm 波长下的变化速率定量计算出酶活力。
基本反应式为：β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2OH2O2+邻联茴香胺氧化型邻联茴香胺+2H2O1实验部分1.1仪器设备北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
饲料中木聚糖酶活性测定_(1)
东莞泛亚太生物科技有限公司研发方案一、实验目的：测定颗粒饲料中木聚糖酶活性，考察饲料调质制粒过程中对木聚糖酶活性的影响。
二、试验方案⒈、饲料中木聚糖酶活性标准曲线的制作[1]根据饲料中添加木聚糖酶含量，配制梯度浓度木酶的标准酶液A；[2]空白饲料样品：从饲料厂取粉碎粒度均匀的适量未加酶制剂饲料样品，包括粉料和颗粒料，分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[3]空白饲料样品加酶后处理：称取7 份空白饲料样品，先粉碎，（约3～4g，须预实验进一步确定保证其吸光度在0.300左右），然后加入木酶缓冲液振荡混合15min，然后依次加入6份不同体积的酶液A（其中一份饲料原料不加入酶液A），定容，摇匀，离心得到上清酶液；[4]空白饲料样品及加酶后样品的还原糖含量OD540值测定：参照APAC实验室木酶检测方法，测定[3]中上清液的OD吸光值；540[5]标准曲线的绘制：以OD540值为横坐标,以0.2ml上清液中所含木聚糖酶活力（U/g）为纵坐标Y，绘制OD 值-酶活梯度曲线。
空白：以0.20ml缓冲液替代0.2ml上清液，其它操作步骤同上。
⒉调质制粒饲料中木聚糖酶活性的测定[1]制备木聚糖酶单酶样品30000U/g，运用APAC实验室检测方法先测定木聚糖酶酶活；[2]在饲料中添加200g木聚糖酶样品，样品用玉米粉(40目)逐级稀释至20kg，再与其他原料混合（因此，要求预混料中没有酶制剂，这步骤要与兴业协商），并且饲料配方组成及原料要最大程度与上述1[2]的空白饲料样品一致；[3]分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[4]称取3中的加酶饲料（添加木聚糖酶），先粉碎，加入木酶缓冲液定容、振荡15min、离心取上清。
随后参照标准曲线制作方法测其吸光值，并根据标准曲线计算得出其酶活；[5]根据不样品的酶活性结果计算调质、制粒过程中对酶活性的损失率。
β-葡聚糖酶活性测定
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
饲料添加剂中纤维素酶活力的标准测定方法
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饲 料 添 加 剂 中 纤 维 素酶 活 力 的 标 准 测 定 方 法
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_饲用植酸酶活性的测定_分光光度法_新旧国标变化及解读
2009年第20期从2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》标准正式实施。
随着植酸酶的大规模应用，饲料企业如何选择和鉴别植酸酶产品的问题，已经成为使用者的当务之急。
在众多影响使用效果的因素中，产品本身的原因主要包括酶的种源、含量、温度稳定性、容重、pH 特性及体内水解效率等，其中酶活含量是最重要的质量指标。
GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》是在参考了AOAC 方法的基础上制定的，在国标颁布之初，由于市场上的植酸酶菌种相对单一，国标检测方法具有普遍的代表性，对植酸酶的生产、应用和检测起到了很好的指导作用。
随着植酸酶的逐渐普及，特别是在2004年以后，国内对植酸酶的研究开发进展迅速，有大量采用不同菌种发酵的植酸酶相继问世，GB/T18634-2002在检测新型植酸酶产品上显现出缺陷和不足，直接影响到检测结果的准确性。
这次标准的修订为植酸酶的制造、贸易、应用甚至纠纷仲裁、以及加酶饲料的质量控制和检测方法的统一都提供了充分的依据，也是植酸酶发挥效果的基本前提。
下面结合生产检测实际，谈谈新旧国标的主要区别：1缩小了方法的适用范围新标准（GB/T 18634-2009，以下同）适用范围删去原国标（GB/T 18634-2002，以下同）中规定的“添加有植酸酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料”。
修订为：“本标准适用于饲料添加剂用植酸酶产品、也适用于添加有植酸酶的配合饲料”。
预混合饲料、浓缩饲料中金属离子浓度高，成分复杂，对样品干扰大，随着样品保存时间的延长，酶的活性很不稳定，用现行的提取条件不能将酶活提取完全，检测结果不准确。
因此，新国标适用范围中去掉了“添加剂预混合饲料、浓缩饲料”，保留“添加剂用植酸酶产品、配合饲料”。
后两类产品按照新标准的方法检测均能达到较好结果。
2调整了最低检出限量和添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差方法最低定量限由原标准的“90U/g ”调整为“130U/g ”。
饲用植酸酶活性的测定
饲用植酸酶活性的测定一、适用范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。
适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
样品最低检出量为90U／kg。
二、方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解低物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。
三、试剂和溶液3.1乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa·3H2O)为0.25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠于1000 mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01。
室温下存放2个月有效。
3.2乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)为0．25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调pH至5.50±0.01，室温下存放2个月有效。
3.3植酸钠溶液，c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(3.1)溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。
3.4硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5100g／L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。
容量瓶中，加入1．0mL 氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.62.35 g／L钒酸铵溶液：称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL 硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。
避光条件下保存一周有效。
3.7颜色终止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份钼酸铵溶液(3.5)，1份钒酸铵溶液(3.6)混合后使用，现用现配。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活性测定的数据计算公式
酶活性测定的数据计算公式酶活性测定是生物化学实验中常用的一种方法，用来测量酶在特定条件下的活性水平。
酶活性的测定对于研究酶的功能和特性，以及对酶的应用具有重要意义。
在进行酶活性测定时，需要根据实验数据计算酶活性的值，这就需要用到酶活性测定的数据计算公式。
酶活性测定的数据计算公式是根据酶活性的定义和测定方法来推导的。
酶活性通常是以单位时间内酶催化反应所产生的产物的量来表示的，常用的单位包括国际单位（U）和摩尔/分钟（mol/min）。
在测定酶活性时，通常需要测量酶催化反应产生的产物的量，然后根据测量数据计算酶活性的值。
酶活性测定的数据计算公式通常包括以下几个参数，反应产物的浓度、反应时间、反应体积、酶的载体蛋白量等。
根据不同的酶活性测定方法，这些参数可能会有所不同。
下面我们将介绍几种常用的酶活性测定方法及其相应的数据计算公式。
一、比色法测定酶活性。
比色法是一种常用的酶活性测定方法，通过测量酶催化反应产生的产物的吸光度来确定酶活性。
在比色法测定酶活性时，通常需要测量反应产物的吸光度，并根据吸光度的变化来计算酶活性的值。
比色法测定酶活性的数据计算公式如下：酶活性（U）=（ΔA/min）/ε×V。
其中，ΔA为单位时间内吸光度的变化量，ε为产物的摩尔吸光系数，V为反应体积。
通过测量单位时间内吸光度的变化量，然后根据吸光度的变化量、摩尔吸光系数和反应体积来计算酶活性的值。
二、酶标记法测定酶活性。
酶标记法是一种通过标记酶的载体蛋白来测定酶活性的方法，通过测量标记物的放射性或荧光强度来确定酶活性。
在酶标记法测定酶活性时，通常需要测量标记物的放射性强度或荧光强度，并根据强度的变化来计算酶活性的值。
酶标记法测定酶活性的数据计算公式如下：酶活性（U）=（ΔC/min）/ε×V。
其中，ΔC为单位时间内标记物的强度变化量，ε为标记物的摩尔放射性或荧光强度系数，V为反应体积。
通过测量单位时间内标记物的强度变化量，然后根据强度的变化量、摩尔放射性或荧光强度系数和反应体积来计算酶活性的值。
饲用植酸酶活性的测定—分光光度法
饲用植酸酶活性的测定—分光光度法一、术语和定义在温度37℃、pH值5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
二、原理植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。
在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415nm下进行比色测定。
三、试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
清洗试验用器皿不要用含磷清洗剂。
1、磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。
2、乙酸缓冲液(I),c(CH3COONa)=0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。
室温下存放2个月内有效。
3、乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa)=0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。
室温下存放2个月内有效。
4、底物溶液，c(C6H6O24P6Na12)=7.5mmol/L：称取0.69g植酸钠(C6H6O24P6Na12，相对分子质量为923.8,纯度为95%)，精确至0.1mg，置于100mL烧杯中，用约80mL乙酸缓冲液I溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液I定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。
5、硝酸溶液：1＋2水溶液。
6、钼酸铵溶液，100g/L：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于50mL烧杯中加水溶解，必要时可微加热，再转移至100mL容量瓶中，加入1.0mL氨水(25%)用水定容至刻度。
MBTH法测定饲料中木聚糖酶的活性
木 聚糖 是 植 物半 纤 维 素 的主 要成 分 ， 是 自然 界
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中含量丰富的可再生资源。木聚糖是饲料中含量较 类化合物 姗 ， 还可与含羰基的化合物反应【 “ 】 。因此 ， 高的抗 营养 因子 ， 不能被动物消化道所吸收 ， 并且 张永 勤等［ １ ２ ＿ ３ 】 已将其用于木聚糖酶 的检测 ， 该法灵 阻碍其他 营养成分 的消化利 用 ， 因此 ， 饲料 中常添 敏度 高 ， 理 论 上可 用 于饲 料 中微 量 木 聚糖 酶 活 性 的 由于饲料中存在多种酚 加一定量的木聚糖酶来消除木聚糖的抗营养作用 ， 测定 。但实际应用时发现 ， 类、 醛类等还原性物质 ， 均会 与 Ｍ Ｂ Ｔ Ｈ发生反应 ， 其 提高动物对饲料的利用率［ １ － ２ ］ 。 木 聚糖酶是一类降解 木聚糖分子 中 Ｂ 一 １ ， ４木 反应灵敏度又高 ， 使得样 品空 白的本底颜色过深从 糖苷键的酶系 ， 可将木 聚糖水解 为低 聚木糖 、 木寡 而影响测定 ， 最终导致 Ｍ Ｂ Ｔ Ｈ法的测定效果 大打折 糖、 木二糖 以及少量阿拉伯糖和木糖 的一种复合酶 扣 ， 相 对 于 ＤＮ Ｓ 法 并没 有 明显优 势 【 ｌ ４ Ｊ 。
ａ ｃ ｉ ｄ ｒ ｅ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｒ ａ ｐ ｅ ｓ ｅ ｅ ｄ ｍｅ ａ ｌ ｂ ｙ Ａｓ ｐｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ 昏 ｅ ｒ ｄ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ
ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ ｓ ｔ ａ ｔ ｅ ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ［ Ｊ ］ ． Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｒｅ ｓ Ｉ ｎ ｔ ， ２ ０ ０ １ ， ３ ４ （ ８ ） ： ７ １ ５ － ７ ２ ０ ．
饲料酶制剂测定方法
饲料酶制剂测定方法核心提示：酶制剂活性测定是酶制剂应用效果评价的重要组成部分，也是饲料生产者评价酶制剂的最直接、最经济且有效的方式。
对于不同酶制剂产品，在其测定方法和原理上存在着较大差别。
因此，本文就饲料中常用的几种酶制剂评价方法及其最新研究进展进行简单综述，以便为广大畜牧生产者使用和鉴定酶制剂产品时参考。
木聚糖酶活性的测定目前普遍使用的分析木聚糖酶的方法，主要包括还原糖法、黏度法和以染色底物为基础的方法。
①还原糖和黏度分析法：还原糖分析法没有专一性，不能用来测定饲料中少量木聚糖酶的活性。
但Nelson/Somogyi还原糖法仍然不失为测定纯木聚糖酶制剂的标准方法。
黏度分析法的底物通常是小麦木聚糖(黏度为20cSt～30cSt)，也有用其他的，如来源于燕麦和桦木的木聚糖底物的。
黏度分析法主要用来分析内切酶的活性。
②可溶性的显色底物法：已有各种染色底物用来分析内切1,4-β-D-木聚糖酶。
这些底物包括染色的燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖和小麦木聚糖。
比较三种可溶性染色木聚糖底物的相对灵敏度，azo-小麦阿拉伯木聚糖的灵敏度是最高的。
③不可溶显色底物法：通过染色和交链制备不可溶的木聚糖，这些木聚糖包括燕麦木聚糖、桦木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖，用这些木聚糖制备水不溶的有色底物。
④酶联吸附剂分析法：用来分析饲料中β-葡聚糖酶和木聚糖酶活力的酶联吸附剂分析法(ELSA)。
这种分析法的灵敏度比前面描述的所有方法都高。
β-葡聚糖酶活性的测定可以作用于β-葡聚糖的酶很多，包括内切真菌纤维素酶和细菌β-葡聚糖酶。
①还原糖法：采用还原糖法和黏度法，以纯的β-葡聚糖(从大麦或燕麦中提取)为底物可以直接用来测定β-葡聚糖酶和纤维素酶。
通常是比色法(即Nel-son/Somogyi法)，显色反应与不同聚合度的同源寡糖的还原性末端的含量成比例，由此可以测量酶活。
②黏度分析法：Nelson/Somogyi还原糖法是测定较纯的β-葡聚糖酶活性的理想方法。
《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》新旧国标变化及解读
《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》新旧国标变化及解
读
新旧国标变化
新国标对饲用植酸酶活性的测定——分光光度法有如下变化：
1. 采用了最新的国际标准，将测定植酸酶活性的方法更新为分光光度法。
2. 将植酸酶活性的测定范围从原来的0.02-0.20 U/mL扩大到
0.05-0.20 U/mL。
3. 将植酸酶活性的测定精度从原来的±10%提高到±5%。
4. 将植酸酶活性的测定温度从原来的25℃改为37℃。
解读
新国标对饲用植酸酶活性的测定——分光光度法进行了更新，使测定植酸酶活性更加准确、可靠，有利于更好地保障饲料质量。
新国标将测定植酸酶活性的范围扩大，精度提高，温度改变，使测定更加精确，可以更好地反映植酸酶活性的实际情况，从而更好地控制饲料质量。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。
由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。
给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。
本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。
工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。
消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。
非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。
其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。
酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。
我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、β—葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。
常见饲用酶制剂测定方法
７ 饲用酶制剂对奶牛生产的应用效果
禽的不同基础日粮中， 都有一定的应用效果， 畜禽生产性能
试验数据表明， 复合酶制剂可提高奶牛的生产性能， 其
都有一定的提高。但不同的研究报告报道有不同幅度的提
中产奶量提高 ４．５％～４．８％， 饲料报酬提高 ４．３％。
高， 这不仅和使用酶制剂的性能有关， 也和试验基础日粮的
立即 放冰水浴中冷却至室温， 以 空 白 管 调 零 ， 在 ７２１ 分 光 光
蒸馏水混和， 再徐徐倾入煮沸蒸馏水中 ， 继续煮沸 ２ ｍｉｎ， 冷 度计 ５４０ｎｍ 处比色， 以所得光密度（ＯＤ）值为纵坐 标 ， 以 对 应
却， 加蒸馏水定容至 １００ｍＬ， 使用时配制。 ．
的标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标， 绘制标准曲线。
９ 饲用酶制剂对鱼类生产的应用效果
量及健康状况和试验时间条件下进行试验， 方能得到比较
试验数据表明， 酶制剂可提高鱼类的生产性能， 其中日
客观的对比结果。
３５ !!２００５ 年第 ２１ 卷第 ６ 期
河北畜牧兽医
饲料天地
２ α－ 淀粉酶活力的测定
蒸馏水溶解， 定容至 １００ｍＬ。
淀粉酶可分为 α－ 淀粉酶、β－ 淀粉酶等， 存 在 于 动 物 消
２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０ｍＬ 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 （同时做一空
标 准 稀 碘 液 ： 量 取 碘 原 液 １５ｍＬ， 加 碘 化 钾 ８ｇ， 定 容 至 白）， 用 蒸 馏 水 制 成 每 毫 升 分 别 含 有 葡 萄 糖 ２００、４００、６００、
５００ｍＬ。
８００、１０００μｇ 的标准液。取不同浓度的葡萄糖标准液和蒸馏
１ 蛋白酶活力的测定 １．１ 原理 由于蛋白质或水解产 物 中 含 有 酚 基 的 氨 基 酸（酪 氨 酸 、 色氨酸等）， 在碱性条件下可将福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的 混合物）还原， 而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。因此可 利用这一原理来测定蛋白酶活性， 即以酪蛋白为底物， 在一 定 ｐＨ 与温度下， 同酶液 反 应 经 一 定 时 间 后 ， 加 入 三 氯 乙 酸 以终止酶反应， 并使残余的酪蛋白沉淀而与水解产物分开。 过滤后， 取滤液 （即含有蛋白质水解产物的三氯乙酸液）用 Ｎａ２Ｃ０３ 碱 化 ， 再 加 入 福 林 试 剂 使 之 发 色 ， 比 色 测 定（蓝 色 反 应）光密度的变化。由于反应前后蓝 色 反 应 增 加 的 强 弱 ， 同 溶解在三氯乙酸中蛋白质水解产物的量成正比。因此， 就可 推测蛋白酶活性。该法的准确性及灵敏度都较高， 在国内已 得到公认， 是应用最广的方法。 １．２ 试剂制备 福 林 试 剂 制 备 ： 于 ２０００ｍＬ 磨 口 回 流 装 置 内 加 入 钨 酸 钠 （Ｎａ２ＷＯ４·２Ｈ２Ｏ）１００ｇ， 钼 酸 钠 （Ｎａ２Ｍｏ０４·２Ｈ２０）２５ｇ， 蒸 馏 水 ７００ｍＬ， ８５％的 磷 酸 ５０ｍＬ， 浓 盐 酸 １００ｍＬ， 文 火 回 流 １０ｈ， 加 入 硫 酸 锂（ｌｉ２ＳＯ４）１５０ｇ，蒸 馏 水 ５０ｍＬ， 混 匀 ， 在 冷 凝 器 中 加 入 几 滴 液 体 溴 ， 蒸 沸 １５ｍｉｎ， 以 驱 逐 残 溴 及 除 去 颜 色 ， 溶 液 应 呈黄色。若溶液有绿色， 需再加数滴液溴， 蒸沸除去， 冷却后 定 容 至 １０００ｍＬ， 然 后 用 细 菌 漏 斗 （Ｎｏ： ４～５）过 滤 ， 置 于 棕 色 瓶中保存， 此溶液使用时加 ２ 倍蒸馏水稀释。 ０．４ｍｏｌ ／Ｌ 的 三 氯 乙 酸 溶 液 ： 称 取 三 氯 乙 酸 ６５．４ｇ， 加 蒸 馏水定容至 １０００ｍＬ。 ０．８ｍｏｌ ／Ｌ 的 碳 酸 钠 溶 液 ： 称 取 无 水 碳 酸 钠 ８４．８ｇ， 加 蒸 馏水溶解， 定容至 １０００ｍＬ。
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饲用酶活性测定方法附录A木聚糖酶活力的测定方法A1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。
A2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
A3木聚糖酶活力单位定义在37℃，pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
A4测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
A5.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
A5.1乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
A5.2乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.3氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。
A5.5木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100ml。
A5.6木聚糖溶液，浓度为5mg/mL称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH溶液16mL)，再加入90mL水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。
再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
使用前，适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为12h。
A5.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
A6.仪器与设备A6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
A6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
A5.3分析天平：感量0.001g。
A6.4 pH计：精确至0.01。
A6.5磁力搅拌器：附加热功能。
A7.4以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
A8试样溶液的制备A8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
A8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
A9测定步骤，按下表操作。
反应顺序样品管空白管BK —标准曲线的斜率；C O—标准曲线的截距；M —木糖摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/moL；t —酶解反应时间，min；1000 —转化因子，1mmol=1000umol。
X D值应在0.04—0.10U/ml之间。
如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X=X D·D f （2）式（2）中：X —试样木聚糖酶的活力，U/g（或U/mL）；D f—试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留三位有效数字。
A10. 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
A11. 样品酶活力与建议称样量的对应关系见表3表3 样品酶活力与建议称样量的对应关系木聚糖酶活力（U/g或U/mL）称样量（g或mL）≥2000 0.1-0.2500-1999 0.2-0.5200-499 0.5-1.050-199 1.0-2.010-49 2.0-5.0附录Bβ-葡聚糖酶活力的测定B1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中葡聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂葡聚糖酶产品。
B2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
B3β-葡聚糖酶活力单位定义在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从4mg/mLβ-葡聚糖溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。
B4测定原理β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
B5试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
B5.1葡萄糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/mL：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100mL。
B5.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100mL。
B5.3乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.4氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50。
B5.6β-葡聚糖溶液：浓度为4mg/mL 。
称取β-葡聚糖0.80g，加入10mL无水乙醇，润湿β-葡聚糖2分钟，再加入50mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）。
磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mL）。
然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。
β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
（如冷冻保存，有效期为60天，使用前在4℃条件下解冻）B5.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
B6.仪器与设备B6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
B6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
B6.3分析天平：感量0.0001g。
B6.4pH计：精确至0.01。
B6.5磁力搅拌器：附加热功能。
B6.6电磁振荡器。
B6.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。
B7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL缓冲液（5.5）和5mLDNS试剂（5.7）。
电磁振荡3s，沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。
吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A值。
B7.4以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
B8.试样溶液的制备B8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.5）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.5）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
B8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.5）做适当稀释定容。